2018 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト生細胞の分子夾雑環境における核酸の構造と相互作用の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems |
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| Project/Area Number |
18H04550
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | インセルNMR / 細胞内夾雑 / 核酸構造 / 交換速度 / 安定性 / バイオリアクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内の込み入った環境下においては、タンパク質や核酸の構造、ダイナミクス及び相互作用は、試験管内の希薄環境下とは異なる事が予想されている。細胞内に導入したタンパク質や核酸のNMRスペクトルを直接観測するin-cell NMR法は、この事を検証する上で有力な手法である。我々は毒素タンパク質SLOによって細胞膜に孔を開け、ここから核酸を導入した。導入の際に細胞質及びATP再生系を共存させる事で、導入効率を格段に上昇させる事ができた。これによりヒト生細胞中の核酸のin-cell NMRスペクトルを観測する事に世界で初めて成功した。本研究はこの成果に立脚して遂行した。今回まず生細胞をアガロースゲルに包埋し、これにフレッシュな培地をスペクトルの測定中に供給し続けるバイオリアクターシステムを導入した。これによって細胞が健全な状態でいる時間を大幅に伸ばす事ができ、シグナル/ノイズ比が格段に向上した。良好なイミノプロトンのスペクトルを取得する事で、どのような塩基対が当該核酸中において形成されているのかが即座に分かる。その結果、どのような２次構造が形成されているのかも分かる。今回研究対象とした核酸においては、ヒト生細胞中においてステム＝ループ構造（ヘアピン構造）が試験管内同様に形成されている事が結論された。イミノプロトンと水分子の交換速度を求める事で、塩基対の安定性に関する情報を得る事もできた。その結果、ヒト生細胞中においては試験管内と比べて、ステム領域即ち２重鎖領域における塩基対の安定性が低下している事が分かった。さらにその原因は、細胞中の正電荷を有するタンパク質と当該核酸の非特異的な相互作用である事も示唆された。このように我々が開発したin-cell NMR法によって、ヒト細胞内における核酸の構造、ダイナミクス及び相互作用を研究する事が可能となってきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インセルNMR法に改良型のバイオリアクターを導入する事で、細胞の生存時間を延ばし、NMRスペクトルの質を格段に向上させる事に成功した。また、細胞内分子夾雑環境下における核酸の構造に関する情報をインセルNMR法によって取得する事に成功した。さらに細胞内分子夾雑環境下における核酸の安定性は、試験管内希薄条件下とは異なる事を見出し、その原因についても同定しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内分子夾雑環境下と試験管内希薄条件下における核酸の構造には違いがあるのか、またPEG等を用いた細胞模倣環境下における核酸の構造は実際の細胞中の構造を再現できるのか否かをインセルNMR法によって調べる。また核酸とタンパク質・ペプチドとの相互作用を細胞内で解析する事にも挑戦する。
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Research Products
(6 results)
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[Presentation] In-cell NMR studies on structure and dynamics of DNA and RNA introduced inside the living human cells2018
Author(s)
Yamaoki, Y.,. Nagata, T., Kiyoishi, A., Miyake, M., . Kuan-Heng, L., Takami, S., Kano, F., Murata, M. and Katahira, M.
Organizer
Japan Society of Nucleic Acids Chemistry
Int'l Joint Research
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[Presentation] Observation of imino proton signals of DNA and RNA introduced inside the living human cells by using in-cell NMR spectroscopy2018
Author(s)
Yamaoki, Y., Nagata, T., Kiyoishi, A., Miyake, M., Kano, F., Murata, M. and Katahira, M.
Organizer
XXVIII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
Int'l Joint Research
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[Presentation] The interaction analysis of a cyclic tetraoxazole with telomeric i-motif DNA2018
Author(s)
Masoud, S. S., Yamaoki, Y., Ma, Y., Marchand, A., Winnerdy, F. R., Gabelica, V., Phan, A. T., Katahira, M. and Nagasawa, K.
Organizer
Japan Society of Nucleic Acids Chemistry
Int'l Joint Research
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