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2018 Fiscal Year Annual Research Report

Creation of light-switchable protein degradation system

Publicly Offered Research

Project AreaFrontier research of chemical communications
Project/Area Number 18H04605
Research InstitutionTohoku University

Principal Investigator

小和田 俊行  東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (40584397)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2020-03-31
Keywordsタンパク質分解 / タグタンパク質 / フォトクロミック分子
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、光を用いて細胞内標的タンパク質の分解を任意のタイミングで誘起し、さらに停止させる、という操作技術の創出を目指している。
平成30年度は、FK506結合タンパク質変異体(FKBP12(F36V))に対する光応答性小分子リガンドを開発し、試験管内においてリガンドの光異性化能とタンパク質との親和性を評価した。紫外可視吸収スペクトルの測定の際に、開発した光応答性リガンドに対して330 nmおよび450 nmの光を交互に照射することで、リガンド構造の可逆的変化が起こることが示された。さらに、蛍光偏光解消法を用いることで、異性化に伴ってリガンドのFKBP12(F36V)に対する親和性が変化することが明らかとなった。
開発した光応答性リガンドに対して、細胞内でのタンパク質分解を誘導するための機能性部位として、(1)疎水性タグ構造、ならびに(2)ユビキチンE3リガーゼ結合構造を導入した。今後これらのリガンドを用いて生細胞内でのタンパク質分解誘導実験を行う予定である。
光応答性リガンドの生細胞内での評価に向けて、哺乳動物細胞用発現ベクターにFKBP12(F36V)と緑色蛍光タンパク質(GFP)もしくは赤色蛍光タンパク質(mCherry)との融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだコンストラクトを作製した。いずれのコンストラクトを用いた場合も、ヒト胎児腎細胞(HEK293T)内で融合タンパク質が発現することを、蛍光顕微鏡観察ならびにウエスタンブロッティング解析により確認した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、FKBP12(F36V)に対する光応答性リガンドの合成、光物性評価、ならびに試験管内でのFKBP12(F36V)に対する親和性評価を行った。さらに、タンパク質分解誘導分子への誘導体化、哺乳動物用発現ベクターの構築まで達成しており、研究計画は概ね順調に実施されている。

Strategy for Future Research Activity

タンパク質分解誘導分子の開発と、FKBP12(F36V)と蛍光タンパク質の融合発現ベクターの構築が完了しているため、今後は培養細胞を用いた実験へと移行する。まずは、蛍光顕微鏡観察やウエスタンブロッティング解析を用いたタンパク質分解の評価系を確立する。その後、光照射によってタンパク質分解の促進・停止のスイッチングが可能かを検討する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2019 2018 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 1 results) Book (1 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] Light-wavelength-based Quantitative Control of Dihydrofolate Reductase Activity Using Photochromic Isostere of Inhibitor2019

    • Author(s)
      Takato Mashita, Toshiyuki Kowada, Hiroto Takahashi, Toshitaka Matsui, Shin Mizukami
    • Journal Title

      ChemBioChem

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • DOI

      10.1002/cbic.201800816

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Development of light-switchable protein-protein interaction system for protein degradation2019

    • Author(s)
      Toshiyuki Kowada, Toshitaka Matsui, Shin Mizukami
    • Organizer
      The 1st International Symposium on Chemical Communication (ISCC2019)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 蛋白質ラベル化技術を利用した蛋白質二量体化の光制御2019

    • Author(s)
      小和田俊行, 荒井啓介, 吉村彰真, 松井敏高, 菊地和也, 水上 進
    • Organizer
      日本化学会第99春季年会
  • [Presentation] タンパク質への結合を可逆的に光制御可能なメトトレキセート誘導体の開発2019

    • Author(s)
      間下貴斗, 小和田俊行, 高橋泰人, 松井敏高, 水上 進
    • Organizer
      日本化学会第99春季年会
  • [Presentation] 生体機能解析に供する機能性小分子の開発と蛍光イメージング2018

    • Author(s)
      小和田 俊行
    • Organizer
      平成30年度東日本分析化学若手交流会
    • Invited
  • [Presentation] 可逆的光応答性薬剤の開発2018

    • Author(s)
      間下貴斗, 小和田俊行, 高橋泰人, 松井敏高, 水上 進
    • Organizer
      第29回 万有仙台シンポジウム
  • [Presentation] Photo-switchable Dihydrofolate Reductase (DHFR) Inhibitor2018

    • Author(s)
      Takato Mashita, Toshiyuki Kowada, Hiroto Takahashi, Toshitaka Matsui, Shin Mizukami
    • Organizer
      Tohoku University's Chemistry Summer School 2018
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 光でタンパク質への結合を可逆的に制御可能なリガンドの開発2018

    • Author(s)
      間下貴斗, 小和田俊行, 高橋泰人, 松井敏高, 水上 進
    • Organizer
      第12回バイオ関連化学シンポジウム
  • [Book] イメージングの選び方・使い方100+(原田 慶恵、永井 健治/編)2018

    • Author(s)
      小和田 俊行・水上 進(分担:第9章)
    • Total Pages
      236(担当147-149)
    • Publisher
      羊土社
    • ISBN
      978-4-7581-0375-6
  • [Remarks] 東北大学多元物質科学研究所 細胞機能分子化学研究分野(水上研究室)

    • URL

      http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/mizukami/

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 光応答性化合物2018

    • Inventor(s)
      水上 進、間下貴斗、小和田俊行、松井敏高
    • Industrial Property Rights Holder
      国立大学法人東北大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2018-165991

URL: 

Published: 2019-12-27  

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