2018 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of Molecular Mechanisms Underlying Oncogenesis in HBOC Syndrome
Publicly Offered Research
| Project Area | Conquering cancer through neo-dimensional systems understanding |
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| Project/Area Number |
18H04900
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
笹沼 博之 京都大学, 医学研究科, 准教授 (00531691)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | エストロゲン / BRCA1 / DNA二重鎖切断修復 / トポイソメラーゼ2型 / 乳がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エストロゲン受容体陽性乳がん細胞、MCF-7細胞を使いBRCA1欠損細胞を作製した。この細胞では、エストロゲン曝露によってできるDNA切断修復に欠損があることを明らかにした。エストロゲン曝露によってできるDNA切断は、トポイソメラーゼ２(Top2)が原因であることを、Top2欠損細胞を作製して証明した。これらのことから、エストロゲンの細胞増殖促進作用に加え、BRCA1欠損によってエストロゲンがDNA毒性を持つことを2018年11月に米国科学アカデミー紀要に発表した。エストロゲン曝露により細胞増殖が促進されるが、Top2によるDNA切断との関係は不明である。本研究目的である、「エストロゲン曝露による転写変動」と「Top2によるDNA切断」との関係を明らかにすることを現在行なっている。エストロゲン曝露による「Top2によるDNA切断」部位を同定する実験手法の最適化を行なった。Top2によって切断されたDNA末端には、Top2が共有結合している。ゲノムDNAを超音波破砕によって断片化したのち、DNAに共有結合したTop2を免疫沈降によって精製する。エストロゲン曝露したBRCA1欠損MCF-7細胞を溶解、超音波破砕したのち、抗Top2抗体によってTop2-DNA複合体の精製を行なった。精製した複合体からTop2をタンパク質分解酵素によって消化後、DNAを次世代シークエンサーで解析したところ、エストロゲンに応答したシグナルが見られなかった。その理由として、細胞抽出液中に大量に存在するDNAに共有結合していないTop2が、Top2-DNA複合体の免疫沈降効率を低下させた理由が考えられる。免疫沈降前に、大量に存在するDNAに共有結合していないTop2を超遠心によって除去することによって、「Top2によるDNA切断」部位を同定する実験手法の最適化を完了させる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
エストロゲン曝露による「Top2によるDNA切断」部位を同定する実験手法の確立を目的に、Top2によって切断されたDNA末端には、Top2が共有結合している。ゲノムDNAを超音波破砕によって断片化したのち、DNAに共有結合したTop2を２回の免疫沈降によって精製することを計画した。２回免疫沈降を行う理由は、精製度を上げるためである。この精製したDNA断片を次世代シークエンサーによって解析したところ、エストロゲンに応答したDNA 切断部位のピークが観察されなかった。その理由は、２つある。一つは、細胞抽出液中に大量に存在するTop2が、Top2と共有結合しているDNA断片の免疫沈降効率を大きく低下させたこと、もう一つは、1度目の免疫沈降時にTop2と共有結合しているDNA断片を溶出する目的に使用したSDSが、2度目の免疫沈降時の抗原抗体反応を阻害した可能性である。我々の使用しているTop2抗体は、溶液中のSDSに感受性であること確認した。そのため、免疫沈降を行う前に、細胞抽出液中に大量に存在するTop2を除去する手法を考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までの進捗状況で記載した問題点を解決する目的で、次の実験を計画している。１、細胞抽出液中に大量に存在するTop2を除去するために、細胞抽出液を作ったのち、塩化セシウム溶液を使った超遠心を行う。ペプチド分子は、密度が軽いため塩化セシウム層に入らないが、Top2が共有結合したゲノムDNAは塩化セシウム層を通過し超遠心によって沈殿する。予備実験を行ったところ、この超遠心を行うことで、Top2が共有結合したゲノムDNAだけを精製できることを確認した。Top2が共有結合したゲノムDNAを超音波破砕によって断片化する。断片化したゲノムDNAから抗Top2抗体を使い、Top2-DNA複合体を精製する。Top2-DNA複合体が精製できたかどうかは、次の方法で調べる。免疫沈降物に対しDNA分解酵素処理によってTop2-DNA複合体のDNAを分解する。SDS-PAGEによってTop2のバンドが検出できれば、精製ができたことになる。DNAシークエンス解析は、引き続き共同研究先であるアメリカスローンケタリング癌研究所のScott Keeney博士と共同研究で行う。Keeney博士は、減数分裂期に機能するTop2(Spo11)-DNA複合体の精製に成功した実績があるため、実験手技の最適化に関して適宜議論を行いながら、研究を推進できる。
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[Journal Article] PDIP38/PolDIP2 controls the DNA damage tolerance pathways by increasing the relative usage of translesion DNA synthesis over template switching2019
Author(s)
Tsuda M, Ogawa S, Ooka M, Kobayashi K, Hirota K, Wakasugi M, Matsunaga T, Sakuma T, Yamamoto T, Chikuma S, Sasanuma H, Debatisse M, Doherty AJ, Fuchs RP, Takeda S
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 14
Pages: e0213383
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] BRCA1 Haploinsufficiency Is Masked by RNF168-Mediated Chromatin Ubiquitylation2019
Author(s)
Zong D, Adam S, Wang Y, Sasanuma H, Callen E, Murga M, Day A, Kruhlak MJ, Wong N, Munro M, Ray Chaudhuri A, Karim B, Xia B, Takeda S, Johnson N, Durocher D, Nussenzweig A
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Journal Title
Molecular Cell
Volume: 73
Pages: 1267-1281
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] BRCA1 ensures genome integrity by eliminating estrogen-induced pathological topoisomerase II?DNA complexes2018
Author(s)
Sasanuma H, Tsuda M, Morimoto S, Saha LK, Rahman MM, Kiyooka Y, Fujiike H, Cherniack AD, Itou J, Callen Moreu E, Toi M, Nakada S, Tanaka H, Tsutsui K, Yamada S, Nussenzweig A, Takeda S
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 115
Pages: E10642～E10651
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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