2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidating and controlling the cell-heterogeneity in maturation using kidney organoids
Publicly Offered Research
| Project Area | Integrated analysis and regulation of cellular diversity |
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| Project/Area Number |
18H05108
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高里 実 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40788676)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 腎臓オルガノイド / ヒトiPS細胞 / 分化誘導 / 成熟化 / 1細胞解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、「研究代表者の開発したヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドを誘導する分化系」と「1細胞トランスクリプトーム技術」を組み合わせた実験手法により、腎臓細胞の成熟速度の不均一性が生じる原理を調べる。これを通して、ヒト腎臓発生過程の成熟速度決定メカニズムの解明を目指す。具体的には、ヒト腎臓オルガノイド形成過程の複数時点で細胞を回収し１細胞トランスクリプトーム解析を行う。解析にはt-SNE法を用い、腎臓細胞の成熟速度を可視化する。これによって、腎臓が成熟する過程で、どのようなシグナル経路や遺伝子発現がどのタイミングで増減すると成熟速度に影響が出るのかを調査し、成熟速度決定に関わる因子を同定する。
腎臓オルガノイド内部には大きく分けて、近位尿細管、遠位尿細管、糸球体、血管内皮、間質細胞の5つの細胞群が存在するが、初年度は近位尿細管に注目して、その成熟速度の解析を行った。まずは、細胞解離方法の条件検討や、免疫染色やqPCRによる細胞単離の検証実験を行った。その結果を踏まえ、腎臓オルガノイドの細胞単離を、蛍光活性化セルソーティング（FACS）により達成した。
次に、本研究では様々な成熟度の細胞が含まれる腎臓オルガノイドを経時的にサンプリングする必要があるので、15、19、23，27，31日目の計4時点で腎臓オルガノイドから近位尿細管を単離し、１細胞トランスクリプトーム解析を行った。1時点につき約3000個の細胞を回収した。1細胞の回収には、Chromium（10X genomics社）マシンを用いた。回収した細胞から次世代シーケンサー用cDNAライブラリを作製し、次世代シーケンサーにかけた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、腎臓オルガノイドより1細胞を回収し、そこから次世代シーケンサー用cDNAライブラリを作製し、次世代シークエンスを行うことができた。次年度にデータセットを解析する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次世代シークエンスのデータセットを解析して、近位尿細管細胞が成熟化する分子メカニズムを明らかにする。次世代シークエンスで得られたマトリックスデータの解析にはt-SNE法を用い、近位尿細管の成熟経路を可視化する。これによって、各近位尿細管細胞が成熟化する過程で、どのようなシグナル経路や遺伝子発現がどのタイミングで増減するかを経時的・網羅的に調査し、成熟化速度の決定に関わる因子を同定する。次に、この成熟速度の速い（もしくは遅い）細胞で、どのようなシグナル経路や遺伝子発現が増減しているのかを調べる（pathway analysis）。この比較解析を繰り返すことで、成熟速度を制御している可能性のある因子を同定する。
最後に、上で得られた知見に基づき、同定されたシグナル経路を、同定された組み合わせを使い、同定されたタイミングで腎臓オルガノイド作成系に導入することで、実際に近位尿細管の成熟速度を任意に制御できるかどうかを確認する。
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