2019 Fiscal Year Annual Research Report
RFFL による形質膜タンパク質品質管理作動機構の解明と CF 創薬への応用
Publicly Offered Research
| Project Area | New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies |
|---|
| Project/Area Number |
19H05300
|
|---|
| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
|---|
Principal Investigator |
沖米田 司 関西学院大学, 理工学部, 教授 (90398248)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ユビキチンリガーゼ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
A1. RFFL fragment 由来 RFFL-ΔF508 NBD1, RFFL-UbcH5c PPI 阻害ペプチドの同定：RFFL ペプチドライブラリーを用いた AlphaLISA により，複数の RFFL- ΔF508 NBD1 PPI 阻害ペプチドを同定した．RFFL-UbcH5c PPI に関しては，精製タンパク質を用いた AlphaLISA は確立できなかったが，NanoBiT法による細胞内相互作用の定量に成功した．
A2. RFFL複合体の大量調製・結晶化：RFFL タンパク質の大量精製を行い，結晶化を行ったが，結晶は得られなかった．
A3. CF-HBE における CFTR 活性評価法の確立：CF治療薬の前臨床試験の最終評価系である ΔF508ホモ変異を持つCF患者気道上皮初代培養細胞（CF-HBE）における ΔF508 CFTR イオンチャネル活性評価法を確立した．分化したCF-HBEに CF治療薬 Orkambi を48時間処理し，ΔF508-CFTR塩素イオンチャネルの機能をUssing chamberを用いた短絡電流測定法で測定した結果，CF治療薬の有効性を評価できた．
B1. 形質膜 CFTR のユビキチンコードの解明：post-Golgi 及び形質膜に存在する ΔF508 CFTR-His-Biotin を BHK 細胞ミクロソーム分画から Ni beads 及び Neutravidin beads を用いたタンデムプルダウンにより変性状態で精製した．精製 CFTRを Ubiquitin-AQUA/PRM法で解析し，ユビキチンコードの絶対定量を行った結果，小胞体とは異なるポリユビキチン化パターンが得られた．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RFFL 結晶構造解析には成功していないが，他の研究計画は予定通り進展している．
|
| Strategy for Future Research Activity |
RFFL タンパク質の特性から，結晶構造解析ではなく，NMR による構造解析を進める．
また，RFFL PPI 阻害ペプチドのみに執着せず，低分子化合物リガンドを利用した RFFL PPI 阻害方法も追求する．
|
Research Products
(9 results)
