2020 Fiscal Year Annual Research Report
生殖幹細胞の全能性を保障する多階層的な非ゲノム情報の複製機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
|---|
| Project/Area Number |
20H05390
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
甲斐 歳恵 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (40579786)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | キイロショウジョウバエ / 生殖細胞 / 転写因子 / DamID / HemK2 / 6mA修飾 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
キイロショウジョウバエの雌生殖細胞維持に必須なStand still (Stil)は、BEDタイプのZincフィンガーをもち、生殖細胞特異的な転写因子、またはインスレーターであると考え、そのクロマチン制御機構の解明に取り組んだ。Stilが相互作用しているクロマチン領域を同定するために従来から用いられているChIP-seq法やCUT&RUN法を行ったが、良好な結果が得られなかった。そこで、近年に応用され始めたDamID法（アデニンのメチル化酵素DamとStilの融合タンパク質を生殖細胞に発現させ、メチル化されたStilの存在する近傍領域を次世代シーケンサーで解析を行う。現在、Damの導入遺伝子を持ったハエの作製に成功し、サンプル調整は順調である。Stilの変異体を用いたRNA-seq解析や遺伝学的解析から、Stilは減数分裂、特に減数分裂時の組み換えを制御していることを明らかにした。これらより、生殖細胞を制御するStilの分子機能は明らかになりつつあり、今年度中に論文投稿を目指す。
HemK2は、ゲノムDNAのアデニンのメチル化（6mA）を付加する酵素と考えられている。HemK2を雌の生殖細胞でノックダウンしたショウジョウバエでは、卵母細胞の発生中間期でアポトーシスが誘導され、成熟した卵細胞は見られなかった。6mAを認識する抗体を用いて、生殖細胞ゲノムDNAの修飾状態を免疫染色法にて調べたところ、野生型とHemK2ノックダウンとでは、顕著な差は見られなかった。一方、野生型卵巣のゲノムDNA、及びHemK2をノックダウンした卵巣のゲノムDNAに対して、修飾塩基を検出可能なナノポア法で6mA部位を探索したところ、HemK2依存的な6mA部位がゲノム上で200箇所程度見つかった。さらに、6mA部位の修飾割合の高い部位に注目して、その部位を認識するリーダータンパク質を探索する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
野生型ショウジョウバエの卵巣からゲノムDNAを調製し、ナノポア法を用いて、DNA塩基修飾の解析を行っている。これまでに、主要なメチル化修飾（5mCと6mA）については、インフォマティックス解析ツールを用いて、修飾塩基を同定するパイプラインを構築した。
Stilタンパク質はBEDタイプのZincフィンガーを持ち、生殖細胞の核内ではDNAに局在しているが、体細胞や、C末欠損Stil はDNAに局在しないことから、生殖細胞特異的に、Stilタンパク質のC末側を通じてDNAにリクルートする因子が存在すると予想される。その因子を同定する目的で蛋白質免疫沈降法を行なったが良好な結果が得られなかった。その代替案として、「近位依存性ビオチン標識」（BioID）法と質量分析によって転写因子であるCtBPを同定し、ウェスタンブロットで結合を確認した。また、Stilがインスレーターとして制御している遺伝子の同定を行うために、クロマチン免疫沈降法(ChIP)を行ったが、バックグラウンドが高く、好ましい結果は得られなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
【生殖幹細胞ゲノムDNA の塩基修飾とその修飾部位の同定】2021年度には、ゲノムDNAの6mA修飾を産生すると考えられている遺伝子（HemK2）の機能解析を行う。
HemK2遺伝子発現をノックダウンしたショウジョウバエ（HemK2-KD）では、卵巣の発達が損なわれることを確認している。HemK2-KDの卵巣ゲノムDNAを調製し、HemK2のメチル化活性、及び塩基配列特異性を解析する。また、腸から調製したゲノムDNAの塩基修飾部位との比較によって、卵巣特異的な修飾部位を同定する。
6mA修飾を認識する遺伝子（リーダー蛋白質）の候補をノックダウンし、修飾度への影響を調べることによって、修飾情報の複製への関与を検証する。
【染色体高次構造が生殖幹細胞で「複製」される仕組みの解析】上述の通り、Stil蛋白質と相互作用し、StilをDNA へリクルートする因子を同定するために、「近位依存性ビオチン標識」（BioID）法と質量分析によって転写因子であるCtBPを同定した。今年度は、他の相互作用因子をさらに同定するため、BioIDで網羅的な相互作用タンパク質の探索を行う。また、前年度、良好な結果を得られなかったクロマチン免疫沈降の代替として、近年開発されたシグナル検出感度が高い「CUT&RUN」を行う。また、同様にDNA結合領域を同定する手法である「DamID-qPCR」で確認する。生殖幹細胞を制御するStil の分子機能は明らかになりつつあり、今年度中に論文投稿を目指す。
|
