2021 Fiscal Year Annual Research Report
(6-4)光回復酵素によるDNA修復過程の分子動画撮影
Publicly Offered Research
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
20H05442
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山元 淳平 大阪大学, 基礎工学研究科, 准教授 (90571084)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | DNA修復 / DNA損傷 / 光回復酵素 / 反応解析 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA修復酵素の一つである(6-4)光回復酵素による修復反応を時分割シリアルフェムト秒X線結晶構造解析によって追跡することを目的とし、クラミドモナス由来動物類縁型クリプトクロム（CraCRY）と損傷DNA複合体の共結晶作成およびSACLAでの構造解析を行なった。DNA配列に工夫を施すことで、酵素-DNA複合体の微結晶を再現性良く作成することに成功した。酸化型FADを有するCraCRY-DNA複合体の三次元構造を2.2オングストロームの分解能で解いたところ、従来の低温シンクロトロン構造とは異なり、DNA修復活性に重要なヒスチジン側鎖の配向が常温では揺らいでいることが明らかとなった。DNA修復活性を示す二電子還元型FADH-を有するCraCRY-DNA複合体共結晶を得るため、暗下嫌気条件下にて共結晶化を行なったところ、DNA修復活性を有する共結晶の作成にも成功した。今後、SACLAにて時分割測定を行う。
また、溶液中におけるDNA修復反応の追跡のため、修復反応に伴い過渡的に形成する中性FADHラジカルの寿命を測定したところ、1光子目の反応は40マイクロ秒で、また2光子目の反応は200ナノ秒で進行することを見出し、学術誌に投稿・受理された。これは時分割実験において重要な入力パラメーターであるため、この知見をもとにして今後SACLAでの実験を進める。さらに、赤外分光法による構造解析を行うため、反応に関与すると考えられる損傷内のヒドロキシ基酸素原子を重原子へと置換したDNA基質を合成し、兵庫県立大・久保教授のグループと共同研究を行った。現在、反応中間体と考えられる信号が得られており、今後重原子置換基質を用いて中間体の構造同定を進める。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(8 results)
