2021 Fiscal Year Annual Research Report
Time-resolved structural analysis of small GTPase Ras signaling transduction by utilizing caged-GTP-coupled Ras protein
Publicly Offered Research
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
20H05444
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
島 扶美 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (60335445)
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| Project Period (FY) |
2020-10-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 分子動画 / シグナル伝達 / Ｘ線自由電子レーザー / 核磁気共鳴法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①光制御下でのcage離脱速度がより速いpHPcagedGTP 型H-Rasを用いたSFXを実施＞ポケット開閉運動初期のデータ収集目的で合成経路の探索・外注試験合成（ナード社）を行っていたpHPcagedGTPの入手が完了した。H-Rasとの複合体を作成し、光照射下GTP加水分解反応を観察するためのin vitro試験を実施したところ、光照射後GTP型の産生が確認できたため、Rasとの複合体の結晶化条件のスクリーニングを行った。その結果、複数の条件で単一結晶の生成が確認できた。
②一方、pHPcagedGTP・Ras複合体の光非照射下(cage離脱反応前)・X線結晶解析では、GDP型あるいはGDP/GTP型の識別困難なRasの構造が確認されたことから、前年度に使用したNPEcagedGTPに比して量子収率が格段に良好なpHPcagedGTPの使用にあたっては、光照射前にcage離脱を防止するためのより厳密な溶液調整条件の検討が必要と考えられた。
③GTP加水分解の構造パスウェイ解明のための、pHPcagedGTP 型H-Ras微結晶を用いた照射・固体31P_ NMRの詳細な解析では、 cage離脱後State 1からState 2を経てGDP型が生成することが立証された。固体NMR測定によりState変化を経たGDP型生成において重要であることが確認された、いくつかのタイムポイントにフォーカスしたSS/ROX測定を実施した結果、前年度の光照射HSQC_NMR測定とアミノ酸残基ごとのkinetics解析により同定したRasのGTP加水分解の新規駆動領域「アロステリック領域（α３ヘリックスとP-loop）」の構造変化が、GDP型生成前に起こることが証明された。
④以上の研究成果を、第94回日本生化学会大会等に発表するとともに、論文発表の準備段階にある。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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