2021 Fiscal Year Annual Research Report
Observation of NO reduction reaction in the active site of metalloenzyme by molecular movie
Publicly Offered Research
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
20H05451
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (00548993)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 金属酵素 / 一酸化窒素 / X線自由電子レーザー / 時間分解計測 / 反応中間体 / ヘム / 嫌気条件 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘム鉄および非ヘム鉄からなる膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）の複核活性中心で行われる一酸化窒素（NO）還元の反応機構の解明のために、X線自由電子レーザーを利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応途中の構造を明らかにすることを目的としている。これまでの研究から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解計測が可能であることを示してきており、本課題では、NORの結晶試料にケージドNOを浸潤させた試料を用い、時間分解構造解析を行うことを計画している。NORによるNO還元反応は、還元型NORにNOが結合することで進行するため、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐことが重要となる。つまり、NORの反応を時間分解構造解析により追跡するためには、嫌気条件下での時間分解X線構造解析を行う必要がある。そこで、本課題では、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを考えた。
昨年度の実験からエチレン・ビニルアルコール共重合体からなる酸素バリア性フィルムを用いることでNORの還元状態を保持することができることを見出したので、引き続き同フィルムを用いて実験を行った。酸素バリア性フィルムを用い、サンドイッチ法により脂質キュービック相（LCP）法で結晶化を行い、酸化型NORの結晶を得た。得られた結晶をフィルム事くり抜き専用のホルダに貼り付けることで、フィルムを開封することなくX線回折実験を行った。フィルムによる強い散乱が生じるものの、結晶化条件の最適化の結果、2.4 Åの分解能で構造解析を行うことができた。また、ケージドNO存在下でも良質な結晶を得ることがきており、今後の時間分解計測にむけての準備が整ったと言える。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II2021
Author(s)
Kwon H., Basran J., Pathak C., Hussain M., Freeman S. L., Fielding A. J., Bailey A. J., Stefanou N., Sparkes H. A., Tosha T., Yamashita K., Hirata K., Murakami H., Ueno G., Ago H., Tono K., Yamamoto M., Sawai H., Shiro Y., Sugimoto H., Raven E. L., Moody P. C. E.
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Journal Title
Angewandte Chemie International Edition
Volume: 60
Pages: 14578～14585
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography2021
Author(s)
Nomura T., Kimura T., Kanematsu Y., Yamada D., Yamashita K., Hirata K., Ueno G., Murakami H., Hisano T., Yamagiwa R., Takeda H., Gopalasingam C., Kousaka R., Yanagisawa S., Shoji O., Kumasaka T., Yamamoto M., Takano Y., Sugimoto H., Tosha T., Kubo M., Shiro Y.
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 118
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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