2022 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of ubiquitin ligase substrates and development of protein degradation method using evolutionary molecular engineering
Publicly Offered Research
| Project Area | New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies |
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| Project/Area Number |
21H00273
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
寺井 琢也 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00508145)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ユビキチン / 進化分子工学 / タンパク質分解 / cDNA display / 人工抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「①特定のE3に選択的に認識・分解されるペプチド配列の同定」については前年度の研究の過程で、E3によるin vitroユビキチン化反応が再現性に欠ける結果であったため、種々検討を行ったところ、反応に用いる一部の酵素が失活しやすくそれまでの保存条件に問題があったことが判明した。保存方法を変更した後は概ね安定して結果が得られるようになったため、p53ペプチドの一部をランダム化したdisplay分子ライブラリーを調製し、MDM2によるユビキチン化と抗体によるプルダウンからなるセレクションを数回繰り返した。しかし定量PCRによる評価の結果、セクション前後で一定の回収率の上昇が見られたものの、十分な増大には至らなかった。その原因として、ランダム化していない固定領域内に複数のリジン残基があり、それらが一部ユビキチン化されてしまう事が考えられた。そこでライブラリーの設計を見直して現在セクションをやり直している。ここで十分な回収率の上昇が達成されれば、配列解析によってMDM2の基質認識に関する新たな知見が得られると期待される。
また「② 標的タンパク質に結合する新規VHHの探索と、刺激依存的な分解誘導」については、VHHに類似したVNARライブラリーを用いて、プロテアソーム関連タンパク質に対する結合分子の取得を目指した。しかしcDNA display分子は形成されるものの、なぜかタグペプチドを用いた精製に難航し、最終的なライブラリーの多様性が期待より低く留まっている。今後はこの点を改善した上で、セレクションへと進めたい。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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