2021 Fiscal Year Annual Research Report
Snapshot analysis of stop codon read-through by cryo-electron microscopy
Publicly Offered Research
| Project Area | Multifaceted Proteins: Expanding and Transformative Protein World |
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| Project/Area Number |
21H05712
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2023-03-31
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| Keywords | リードスルー / ストップコドン / リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の翻訳はmRNAの開始コドンから終止コドンまでの遺伝情報に基づき正確にアミノ酸を繋いでタンパク質を合成する生命現象であるが、必ずしも終止コドンでタンパク質合成が終結していないことがわかってきた（これをリードスルーとよぶ）。本研究では、最新のクライオ電顕単粒子解析の手法を用いて終止コドンのリードスルーの瞬間を原子分解能で捉え、その分子機構の詳細を明らかにすることを目的とする。2021年度はGFPのORF中にTGA、TAG、TAAの終止コドンを挿入し、これらのストップコドンをリードスルーして合成された全長のGFPをC末端に付加したHisタグでアフィニティ精製した。その結果、種類や場所によりリードスルーの活性が異なることが明らかになった。終止コドン領域の詳細な構造を明らかにすることを目指し、精製されたリードスルー産物を用いて結晶化を試みたが、良質な結晶を得ることはできなかった。しかし、緑色蛍光が観察されたことから、リードスルー産物も野生型と同様の3次元構造を形成していることがわかった。さらに、精製したリードスルー産物を質量分析により詳細に解析し、終止コドン周辺領域のアミノ酸配列を決定した。クライオ電顕については、終止コドンがAサイトに結合するような条件でリボソーム-mRNA-tRNA複合体を調製し、その立体構造を決定した。高分解能の構造を決定することができ、Pサイトにおけるコドンーアンチコドン対合の様子を可視化することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
終止コドンに導入されるアミノ酸を同定したほか、クライオ電顕単粒子解析によりリボソーム-mRNA-tRNA複合体の高分解能構造も明らかにすることができており、順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
終止コドンにtRNAが対合した状態の高分解能構造を取得することが重要である。mRNAの配列を調整し、終止コドンがAサイト、Pサイトに結合した状態のリボソームを調製し、そこに終止コドンと追号するアミノアシルtRNAを結合させた状態でクライオグリッドを作成し、データ収集、構造解析を行う。データ収集および構造解析の条件等については、これまでのリボソームの構造解析の条件を踏襲する。
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Research Products
(14 results)
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[Journal Article] A marine sponge-derived lectin reveals hidden pathway for thrombopoietin receptor activation.2022
Author(s)
Watari H, Kageyama H, Masubuchi N, Nakajima H, Onodera K, Focia PJ, Oshiro T, Matsui T, Kodera Y, Ogawa T, Yokoyama T, Hirayama M, Hori K, Freymann DM, Komatsu N, Araki M, Tanaka Y, Sakai R.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 13
Pages: 7262
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Crystal structure analysis of LanK complexed with landomycinA, a potent antitumor antibiotic2022
Author(s)
Atsushi Tsugita, Shiro Uehara, Takashi Matsui, Takeshi Yokoyama, Iryna Ostash, Maksym Deneka, Subbarao Yalamanchili, Clay S. Bennett, Bohdan Ostash, and YoshikazuTanaka
Organizer
e-Asia Joint Symposium on “Marine Biodiversity as a Source of New Chemotypes”
Int'l Joint Research
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