2022 Fiscal Year Annual Research Report
神経変性疾患に関わる凝集体の形成・抑制の in situ 構造生物学
Publicly Offered Research
| Project Area | Multifaceted Proteins: Expanding and Transformative Protein World |
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| Project/Area Number |
21H05733
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
山形 敦史 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (20463903)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2023-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 凝集体 / アミロイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵母プリオンの細胞内凝集体の構造解析を目指し、蛍光標識された細胞内凝集体を標的にしたcryo-FIB millingによる薄片化とクライオ電子線トモグラフィーによる解析に挑戦した。出芽酵母の[psi+]株内にGFP標識Sup35NMタンパク質を発現させ細胞内凝集体を形成させたところ、凝集体と思われるドット状の蛍光体を確認した。さらに低濃度の塩酸グアニジンの添加によってロッド状の蛍光体に変化することを確認し、二つの異なる状態の凝集体を形成させた。培養した酵母をそのままグリッドに急速凍結させた後、理化学研究所・横浜事業所のcryo-FIBSEM（Aquilos2）を用いてクライオ条件下での薄片化（ラメラ化）を行なった。得られたラメラを同事業所の加速電圧300kVの透過電子顕微鏡（Titan Krios）を用いて、トモグラフィー測定を行なった。複数のラメラのトモグラフィー測定を行い、解析した結果ミトコンドリアや核膜を確認できた。また細胞内の微小管も確認することができた。しかし、細胞内の凝集体については確認することができなかった。新たにcryo-FIBSEMに蛍光顕微鏡ユニット（iFLM）が設置されたので、今後はラメラ化と蛍光標識を同時に行うことにより、ラメラ内の凝集体を確認した上でのトモグラフィー測定を行う。
次に、培養細胞を用いてアミロイドβ線維やタウ線維のin situ構造解析に挑戦した。Aβ（1-42）、タウのリピートドメイン（3R, 4R）、全長タウ（1N3R）、それぞれのタウに病原性変異（P301L）を導入したものに蛍光タンパク質を融合させた。蛍光タンパク質には mCerulean3, mClover3 のそれぞれを用い、凝集体形成によってFRETが起きるように工夫した。それぞれの遺伝子をpiggyBac系によってゲノムに導入して安定発現株を樹立した。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Structural basis for activation of DNMT12022
Author(s)
Kikuchi Amika、Onoda Hiroki、Yamaguchi Kosuke、Kori Satomi、Matsuzawa Shun、Chiba Yoshie、Tanimoto Shota、Yoshimi Sae、Sato Hiroki、Yamagata Atsushi、Shirouzu Mikako、Adachi Naruhiko、Sharif Jafar、Koseki Haruhiko、Nishiyama Atsuya、Nakanishi Makoto、Defossez Pierre-Antoine、Arita Kyohei
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 13
Pages: 1~11
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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