2011 Fiscal Year Annual Research Report
生細胞内1分子FRET法による回転モータータンパク質のダイナミクス計測
Publicly Offered Research
| Project Area | Molecular Science for Supra Functional Systems ? Development of Advanced Methods for Exploring Elementary Process |
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| Project/Area Number |
22018018
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
飯野 亮太 東京大学, 大学院・工学系研究科, 講師 (70403003)
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| Keywords | 1分子計測 / 蛍光共鳴エネルギー移動 |
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| Research Abstract |
固定子aサブユニットにSNAPタグ、回転子εサブユニットにCLIPタグを導入したF_oF_1に
Alexa647-benzylguanineおよびTMR-benzylcytosineを反応させ特異的結合を確認した。またリポソームに再構成した蛍光標識FoF1の1分子FRET計測を行い、回転子の向きを反映した3段階(L,M,H)のFRET効率が得られた。しかしながらFRETの経時変化計測では、一方向の回転に対応するL→M→H→Lといった順序だったFRET変化をみせた分子の割合は約20%と低く、L→M→Lのように2状態を可逆的に遷移する分子が多くみられた。この原因として、1)タグの位置が適切でなく蛍光色素の位置が一意に決まらない、2)リポソーム膜にきちんと再構成されていないFoF1の割合が高い、等の可能性が考えられた。1)の可能性を検証するため、タグの位置を変えたFoF1を様々に作製し改善を試みた。しかしながら現在までのところ大幅な改善には至っていない(1)。よって2)の可能性が高いと考えられた。
一方、大腸菌ではFoF1の細胞膜への再構成の効率は問題にする必要はない。そこで大腸菌での1分子計測を行うため、蛍光色素で標識後に菌体を培養し蛍光標識FoF1の密度を低下させた。その結果、細胞膜上を拡散する1分子FoF1の観察に成功した。しかしながら、Alexa647-benzylguanineの細胞膜透過性が低く、大腸菌内での1分子FRET計測には至らなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予想と反し、順序だったFRET変化をみせた分子の割合は約20%と低く、L→M→Lのように2状態を可逆的に遷移する分子が多くみられた。Alexa647-benzylguanineの細胞膜透過性が低く、大腸菌内での1分子FRET計測には至らなかった。これらの点を解決する必要が生じたため、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
光活性化蛍光タンパク質を用いた1分子FRET計測に取り組む。またFRET計測だけでなく、回転子と固定子に導入した2種の色素の向きを蛍光偏光で同時に1分子計測して回転速度を見積もる手法も試す。
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Research Products
(6 results)
