2010 Fiscal Year Annual Research Report
天然変性蛋白質Stm1の3本鎖DNA認識機構と遺伝子発現制御機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Target recognition and expression mechanism of intrinsically disordered protein |
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| Project/Area Number |
22113519
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
鳥越 秀峰 東京理科大学, 理学部, 准教授 (80227678)
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| Keywords | 天然変性蛋白質 / 3本鎖DNA / DNA結合蛋白質 / 3本鎖DNA認識 / 遺伝子発現制御 |
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| Research Abstract |
遺伝子発現制御領域の2本鎖DNAの一部がほどけて生じた1本鎖DNAが他の2本鎖DNA領域に結合して分子内3本鎖DNAを形成し、3本鎖DNA結合蛋白質STM1がこれに結合し、下流の遺伝子発現を制御する可能性が指摘されている。筆者は、STM1の1-113アミノ酸が3本鎖DNA結合ドメイン(TBD)であり、2本鎖DNAに結合せず、3本鎖DNAに特異的に結合することを既に明らかにしている。また、STMTBDが3本鎖DNAの塩基配列よりも、3本鎖DNAの形状を認識して結合することも既に明らかにしている。従来^<32>P標識3本鎖DNAを用いたゲルシフト法でSTM1TBDと3本鎖DNAの結合能を解析したが、本年度はビオチン標識3本鎖DNAの調製方法を確立し、Biacoreによるnon RIでの結合能の解析を可能にした。具体的には、3'末端をビオチンで標識した1本鎖DNAと相補鎖DNAをアニーリング後、5'末端をソラレンで標識した3本鎖DNA形成用1本鎖(TFO)と混合して3本鎖DNAを形成し、光クロスリンクでTFOと2本鎖DNAを共有結合で結んだ。反応産物を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、3本鎖DNAをゲルから切り出し、未反応の2本鎖DNAを除いた。精製した3本鎖DNAを再び電気泳動で分離後、ウェスタンブロッティングで膜に転写し、抗ビオチン抗体で3本鎖DNAを検出することができた。このようにして調製したビオチン標識3本鎖DNAを、Biacore用キュベットに固定化して結合能の解析に用いた。BiacoreでSTM1TBDと3本鎖DNAの結合能を様々なイオン強度で解析したところ、イオン強度の増加と共に結合能が減少し、STM1TBDと3本鎖DNAの結合には静電相互作用が重要であることを明らかにした。また、Arg68, Arg69, Lys83, Lys84, Arg88, Arg89, Arg93, Arg96, Lys99をAlaに置換した点変異型STM1TBDと3本鎖DNAの結合能は、野生型STM1TBDと3本鎖DNAの結合能に比べて数倍低下し、これらの変異アミノ酸が3本鎖DNAとの結合に関与している可能性が示された。
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[Journal Article] 2'-O,4'-C-Aminomethylene Bridged Nucleic Acid Modification with Enhancement of Nuclease Resistance Promotes Pyrimidine Motif Triplex Nucleic Acid Formation at Physiological pH2011
Author(s)
Torigoe, H., Rahman, S.M.A., Takuma, H., Sato, N., Imanishi, T., Obika, S., Sasaki, K.
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Journal Title
Chemistry Eur.J.
Volume: 17
Pages: 2742-2751
Peer Reviewed
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[Journal Article] Interrupted 2'-O,4'-C-Aminomethylene Bridged Nucleic Acid Modification Enhances Pyrimidine Motif Triplex-Forming Ability And Nuclease Resistance Under Physiological Condition2011
Author(s)
Torigoe, H., Rahman, S.M.A., Takuma, H., Sato, N., Imanishi, T., Obika, S., Sasaki, K.
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Journal Title
Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids
Volume: 30
Pages: 63-81
Peer Reviewed
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