2022 Fiscal Year Annual Research Report
In cell analysis of chromatin regulating complexes
Publicly Offered Research
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
22H04688
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
宮成 悠介 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 准教授 (60469608)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | クロマチン / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、主にリコンビナント抗体の整備に注力し、10種類のタグ抗体、25種類のクロマチン修飾抗体、８種類の転写因子への抗体を作製することに成功した。タグ抗体に関しては、その抗体の特異性、および結合力を総合的に評価するために、ウエスタンブロット、ELISA、免疫染色、CUT&RUNなど様々なアプリケーションによって、そのパフォーマンスを評価した。現在、その研究結果を論文として投稿すべく、結果を取りまとめている。ヒストン修飾抗体については、特性等の評価をヒストン修飾ペプチドアレイ等を用いて評価した。一部の抗体は、その特異性に問題があったため（他の化学修飾にクロスリアクトしたため）、使用できないと判断されたが、約70%程度のヒストン修飾リコンビナント抗体は、特性試験をパスしている。RNAポリメレースやCBPなどの転写関連因子等への抗体は、ノックアウト細胞などのコントロールを用いることで、その評価を行った。これらのリコンビナント抗体は、最終的にはクロマチンプロファイリングに用いるため、CUT&RUNアッセイによってそのパフォーマンスを評価したところ、概ね良好な結果をえている。実際に、細胞内でのタンパク質複合体やエピジェネティクスとのクロストークを解析するために、それらの抗体を用いてmulti CUT&TAGアッセイの立ち上げを行った。当初よそうしていたよりも、Tn5によるタグメンテーションの効率が低いため、現在Tn5による反応条件の改善をおこなっている。また、本研究において作成したリコンビナント抗体(anti-Survivin 抗体）を用いた研究成果を発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リコンビナント抗体の作成および評価、さらにはノックイン細胞の作成など当初の予定通り進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、調整したリコンビナント抗体を用いて、多次元のmultiCUT&RUNアッセイの立ち上げにまず注力する。また、TFDP1転写複合体の解析などを、multiCUT&TAGアッセイにより行うことで、細胞内における複合体の実態、さらにはエピジェネティクス修飾のクロストークを明らかにする。
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