2023 Fiscal Year Annual Research Report

大腸菌無細胞合成系を利用した光反応性非天然型アミノ酸導入タンパク質調製法の開発

Publicly Offered Research

Project Area	Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
Project/Area Number	22H04759
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	保坂俊彰国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 技師 (40462725)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2024-03-31
Keywords	SACLA / 非天然型アミノ酸 / 大腸菌無細胞合成系 / 時分割結晶構造解析 / X線結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements	大腸菌無細胞合成系を用いたタンパク質の合成系では、任意の位置に非天然型アミノ酸を、ほぼ100％の効率で導入する系が確立されている。本申請課題では、この系を改良し、ケージドアミノ酸、もしくは光異性化アミノ酸導入系の開発を行う。これにより、タンパク質を光により時間・空間的に制御するための強力なツールとして利用できることを示し、SACLA(SPring-8Angstrom Compact Free Electron Laser)などを用いた時分割構造解析実験や、光による機能制御可能なタンパク質の生産など、タンパク質反応機構を見る応用研究へ進めることを目的としている。光に反応する非天然型アミノ酸を導入したタンパク質を調製することができれば、「一般的」なタンパク質についても、時分割構造解析などに適応できるようになることから、「高速分子動画」法を、より多くの生体高分子に適応できるようになることが期待される。非天然型アミノ酸であるケージド-Tyr（o-nitrobenzyltyrosineやo-nitropiperonyl-O-tyrosine）や、アゾ基を持つphenylalanine-4’-azobenzeneに対応するアミノアシル-tRNA合成酵素を作成し、モデルタンパク質であるlysozymeで合成能やケージド基が外れることをX線結晶構造解析で確認した。本成果をまとめて論文にて発表した。実サンプルでの光反応アミノ酸導入 Thermus thermophilus由来ホモイソクエン酸脱水素酵素（TtHICDH）をターゲットとしてケージド-Tyrを導入した。本酵素が光に反応して酵素反応が開始されることを確認した。また、結晶化に成功しケージド-Tyrが本酵素に導入されていること、結晶に光を照射することによりこのケージド基が外れることを構造から確認することができた。
Research Progress Status	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。