2023 Fiscal Year Annual Research Report

逆行性バーコーディングによる局所神経回路構造の解明

Publicly Offered Research

Project Area	Census-based biomechanism of circuit construction and transition for adaptive brain functions
Project/Area Number	22H05495
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	濱口航介京都大学, 医学研究科, 准教授 (50415270)
Project Period (FY)	2022-06-16 – 2024-03-31
Keywords	狂犬病ウィルス / バーコード / カルシウムイメージング / 空間トランスクリプトーム
Outline of Annual Research Achievements	神経細胞には様々な細胞タイプが存在し、複雑な神経回路網を形成している。空間トランスクリプトームの方法は、空間構造を保持したまま、細胞の持つ遺伝子発現パターンを調べる事ができる強力な手法であるが、神経細胞同士の接続情報を調べる事ができない。本研究ではカルシウムイメージング法により活動観察した細胞同士の接続関係を調べるため、バーコード付き狂犬病ウィルスを用い、接続情報を空間トランスクリプトームに付け加える技術、”逆行性バーコーディング”の開発を行った。ウィルスに付与したバーコードを読むには、いくつかの方法が存在する。従来の空間トランスクリプトーム法では、ごく薄い(10μｍ以下)の脳切片に対してRNAシークエンサーの技術を使うことで未知の塩基配列を読む事が可能である。しかし本研究で用いる神経活動を観察した数百μｍの厚みのある脳切片蛍光には適応が難しい。蛍光 in situ hybridization (FISH)　による方法よりは検出感度が高く、厚切りの切片への適応が可能であるが、FISHは既知の配列を検出する方法であり、現状ではランダムな未知の塩基配列を検出に利用する事はできなかった。そこで本研究では、FISHを用いてランダムなバーコード列を検出する方法を開発した。既知のバーコードを用意し、ランダムに接続する方法を用いると、多様性をもったバーコードの配列が生成できる。このバーコード配列は、分割した複数のFISHプローブを結合させる方法により、増幅できる。増幅された長い一本鎖DNA(Rolony)に含まれるバーコードは、繰り返しの染色・洗浄によって読みだされるが、常に同じ粒状の空間パターンを持つため、複数のバーコード列を持つウィルスが感染していても、分離して検出する事ができる事がわかった。よって本研究により、逆行性バーコーディングの技術が開発された。
Research Progress Status	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。