In-cell NMR and structural analysis of ER-Golgi membrane contact site

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: New cross-scale biology
• Project/Area Number: 22H05536
• Research Institution: Yokohama National University
• Principal Investigator: 児嶋 長次郎 横浜国立大学, 大学院工学研究院, 教授 (50333563)
• Project Period (FY): 2022-06-16 – 2024-03-31
• Keywords: NMR / 蛋白質 / 立体構造解析

Outline of Annual Research Achievements

NMRは、X線やCryo電顕では困難な溶液条件下での構造解析を得意とし、細胞内の蛋白質を細胞が生きている状態のまま構造解析できる唯一の手法である。しかし、生細胞内での蛋白質の構造解析は再現性や検出感度に問題があり、ヒト細胞での成功例はない。そこで、本研究では独自技術で超高感度化に成功したin-cell NMR法を発展させ、ヒト生細胞内蛋白質の立体構造解析技術を開発する。また、応募者らが独自開発した液-液相分離(LLPS)状態における蛋白質の構造解析技術などと組み合わせ、LLPS状態の蛋白質の立体構造を生細胞内で解析する技術を開発する。最終的には、これら独自技術と領域内の電子顕微鏡技術・計算機技術・超解像イメージング技術・AFM技術を組み合わせ、生細胞内におけるセラミド輸送蛋白質CERTとEP局在足場蛋白質VAPからなるER-Golgi膜接触領域の立体構造解析を目指している。
2022年度は上記研究目的を達成するために下記３課題を推進した。
(1)分子量6千のモデル蛋白質GB1とHeLa細胞を用いて生細胞内蛋白質の立体構造解析技術を確立し、15N核の緩和時間解析によって生細胞内蛋白質の主鎖の運動性評価技術を確立することで、バッファー中とヒト細胞中での立体構造や運動性の違いを明らかにした。具体的には、バッファー中とヒト細胞中で立体構造に大きな違いはないが、運動性に大きな違いがあった。
(2)LLPS状態のVAP蛋白質の真空紫外円偏光二色性スペクトルの測定を行った。また、溶液NMRの試料管中でVAP蛋白質のLLPS形成実験を行い、その過程をNMRで追跡した。
(3)各種分析手法を用いてCERT蛋白質およびCERT-VAP複合体の立体構造解析の検討を進めた。特に、2022年度はCryo-EMの測定結果を精製条件の検討にフィードバックしながら、Cryo-EMによる構造解析を進めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた研究計画の全てに着手し、一定の成果を得ているため。
進捗が遅れている研究計画もあるが、これらは当初予定通り2023年度に集中して研究を推進する。

Strategy for Future Research Activity

当初予定通り研究を推進する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] UConn Health(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: UConn Health
• [Int'l Joint Research] Czech Academy of Sciences/Czech Technical University(チェコ)
  • Country Name: CZECH
  • Counterpart Institution: Czech Academy of Sciences/Czech Technical University
• [Int'l Joint Research] Korea Basic Science Institute/University of Science and Technology/Chungnam National University(韓国)
  • Country Name: KOREA (REP. OF KOREA)
  • Counterpart Institution: Korea Basic Science Institute/University of Science and Technology/Chungnam National University
• [Journal Article] Biological Magnetic Resonance Data Bank (2022)
  • Author(s): Hoch Jeffrey C、Baskaran Kumaran、Burr Harrison、Chin John、Eghbalnia Hamid?R、Fujiwara Toshimichi、Gryk Michael?R、Iwata Takeshi、Kojima Chojiro、Kurisu Genji、Maziuk Dmitri、Miyanoiri Yohei、Wedell Jonathan?R、Wilburn Colin、Yao Hongyang、Yokochi Masashi
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 51 Pages: D368～D376
  • DOI: 10.1093/nar/gkac1050
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Multifunctional chemical inhibitors of the florigen activation?complex discovered by structure‐based high‐throughput screening (2022)
  • Author(s): Taoka Ken‐ichiro、Kawahara Ikumi、Shinya Shoko、Harada Ken‐ichi、Yamashita Eiki、Shimatani Zenpei、Furuita Kyoko、Muranaka Tomoaki、Oyama Tokitaka、Terada Rie、Nakagawa Atsushi、Fujiwara Toshimichi、Tsuji Hiroyuki、Kojima Chojiro
  • Journal Title: The Plant Journal Volume: 112 Pages: 1337～1349
  • DOI: 10.1111/tpj.16008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMR determination of the 2:1 binding complex of naphthyridine carbamate dimer (NCD) and CGG/CGG triad in double-stranded DNA (2022)
  • Author(s): Yamada Takeshi、Furuita Kyoko、Sakurabayashi Shuhei、Nomura Makoto、Kojima Chojiro、Nakatani Kazuhiko
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 50 Pages: 9621～9631
  • DOI: 10.1093/nar/gkac740
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Physicochemical Characterization of the Catalytic Unit of Hammerhead Ribozyme and Its Relationship with the Catalytic Activity (2022)
  • Author(s): Tanaka Yoshiyuki、Yamanaka Daichi、Morioka Saori、Yamaguchi Taishi、Morikawa Masayuki、Kodama Takashi S.、Sychrovsk? Vladim?r、Kojima Chojiro、Hattori Yoshikazu
  • Journal Title: Biophysica Volume: 2 Pages: 221～239
  • DOI: 10.3390/biophysica2030022
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ¹⁹F chemical library and ¹⁹F-NMR for a weakly bound complex structure (2022)
  • Author(s): Shinya Shoko、Katahira Ritsuko、Furuita Kyoko、Sugiki Toshihiko、Lee Young-Ho、Hattori Yoshikazu、Takeshita Kohei、Nakagawa Atsushi、Kokago Aoi、Akagi Ken-ichi、Oouchi Muneki、Hayashi Fumiaki、Kigawa Takanori、Takimoto-Kamimura Midori、Fujiwara Toshimichi、Kojima Chojiro
  • Journal Title: RSC Medicinal Chemistry Volume: 13 Pages: 1100～1111
  • DOI: 10.1039/d2md00170e
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Crystal structure of potato 14-3-3 protein St14f revealed the importance of helix I in StFDL1 recognition (2022)
  • Author(s): Harada Ken-ichi、Furuita Kyoko、Yamashita Eiki、Taoka Ken-ichiro、Tsuji Hiroyuki、Fujiwara Toshimichi、Nakagawa Atsushi、Kojima Chojiro
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Pages: 11596
  • DOI: 10.1038/s41598-022-15505-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] NMR tools developed for drug discovery and its application to DNA targeting small molecules (2022)
  • Author(s): Chojiro Kojima
  • Organizer: The 7th International Symposium on Drug Discovery and Design by NMR
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 19F-STD NMR for 3D structure modeling of a weakly bound protein-drug complex (2022)
  • Author(s): Chojiro Kojima
  • Organizer: The 4th International Symposium of Structure-Based Drug Discovery & 2022 Annual Conference of the Korean Society for Structural Biology Joint Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited