2022 Fiscal Year Annual Research Report
Functions of supersulfide in animal development
Publicly Offered Research
| Project Area | Life Science Innovation Driven by Supersulfide Biology |
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| Project/Area Number |
22H05556
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
小林 麻己人 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50254941)
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| Project Period (FY) |
2022-06-16 – 2024-03-31
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| Keywords | 超硫黄分子 / ゼブラフィッシュ / 動物発生 / 遺伝子破壊 / 時空間特異的量的変化 / ケミカルプローブ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
超硫黄分子は生命体に有益な効果をもたらすと同時に有害な影響も与える。動物発生の各過程においても重要な機能を果たしていると予想されるが、これまでほとんど研究がなされていない。本研究では、動物発生における超硫黄分子の機能を明らかにするとともに、その時空間特異的な量的変化を解明することを目的とした。戦略には、発生が早く、薬剤処理・ライブイメージング・遺伝学的解析が簡便・迅速にできるゼブラフィッシュを活用することにした。具体的には、１）ゼブラフィッシュ胚・稚魚における超硫黄分子量を増減させ、その影響を観察すること、２）ゼブラフィッシュ胚・稚魚の透明性を活かして、発生に応じて変化する各組織における時空間特異的な超硫黄分子量を測定すること、を２年間で行う計画とした。
初年度はまず、動物発生に対する内因性超硫黄分子量減少の影響を見るために、超硫黄分子を作り出す３種の酵素（CARS2、CBS、CTH）の遺伝子破壊ゼブラフィッシュ系統の作成に取り組んだ。ゼブラフィッシュにはCBSとCTH遺伝子が二つずつあり、cars2、cbsa、cbsb、cth、cthlの5遺伝子の遺伝子破壊をCRSPR-Cas9法で試みた。その結果、全て成功し、現在そのF2世代を育成しているところである。一方、発生過程に伴う超硫黄分子量の時空間特異的変化の測定を、入手可能な既存ケミカルプローブを用いて試みた。その結果、ケミカルプローブ種により、発光の臓器特異性が異なるという興味深い知見が得られ、特定臓器のみを強く光らすプローブを見いだすことにも成功した。このことは、超硫黄分子が特定の臓器形成もしくは臓器機能発揮に何らかの働きを行っている可能性を示唆するものとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由を二つ挙げる。
一つ目は、予定した遺伝子破壊が全て成功したことことである。ホモ破壊胚・稚魚を用いた遺伝子破壊の影響解析まではできていないが、F0世代へのCRISPR RNA注入からF2世代の成魚育成まで最短でも9ヶ月かかることを考えると予定した全ての遺伝子破壊系統の作出に成功したことは順調と言える。残念なことは、cars2の超硫黄分子合成活性のみを破壊したノックイン系統の作出が成功していない点でこれは二年目の最重要課題に掲げる。
二つ目は、超硫黄分子を検出しうるケミカルプローブを用いた解析系のセットアップができ、実際にこれを用いて何らかの時空間特異的な量的変化を見いだしたことである。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、各種遺伝子破壊系統のF2成魚を育成し、これを交配させて作らせるF3胚・稚魚で、遺伝子破壊の影響を観察する。具体的には、超硫黄分子検出用のケミカルプローブを用いて超硫黄分子量の時空間特異的な量的変動を測定するとともに、変動した臓器を中心に、発生異常がないか、各種臓器マーカーを用いて調べる。異常を示した臓器があった場合、新たに超硫黄分子を添加することで表現型が回復するか否かを調べる。微妙な表現型しか示さなかった遺伝子破壊系統があった場合には、1個体RNA-seq法を駆使した異常発生過程の探索を行う。また、表現型がまったく検出されなかった場合には、遺伝子破壊系統同士を交配し、二重破壊系統、三重破壊系統等を作出する。
既存のケミカルプローブでは、超硫黄分子種の特定までは難しいので、超硫黄分子種を特定できる変革領域の他の研究グループと共同研究し、発生過程に沿った超硫分子種の質的変化を質量分析により明らかにする。質量分析では空間的変化はわからないという弱点があるので、もし特定超硫黄分子種のみを検出できるケミカルプローブを開発した研究グループがあれば、これと共同研究し、ゼブラフィッシュ胚・稚魚に活用する。
一方、極度に高い抗酸化状態のため稚魚で致死となるKeap1a;Keap1b二重破壊系統における超硫黄分子量も測定し、稚魚での致死性との相関を検討する。同系統はcbsbの発現が亢進しており、また硫黄酸化に関わるSQR やETHE1 の発現も激増している。
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