糸状菌のキメラ型ジテルペン合成酵素の機能的ドメイン交換酵素の創製

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 23108506
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 豊増 知伸 山形大学, 農学部, 教授 (60272085)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Keywords: ジテルペン / 生合成 / 環化酵素 / ドメイン交換

Outline of Annual Research Achievements

ジテルペンは、炭素数20個のプレニル基質ゲラニルゲラニル2リン酸GGDPより生合成される。糸状菌からはGGDP合成とGGDP環化の２つの反応を１つのペプチドで触媒する極めて珍しいキメラ型ジテルペン合成が同定されている。本研究課題では、いくつかの糸状菌由来キメラ型ジテルペン合成酵素のGGDP環化ドメインについて、αヘリックスに基づくドメイン交換酵素を複数調製し、その中から新規な炭素骨格を形成するものを探索することを目的としているが、本年度も引き続きPaFSとPaPSについて行ったが、目的の組換え酵素は得られなかった。そこで、PCRによるcDNAへのランダム変異導入により新規酵素創製を試みた。変異導入により酵素活性を消失したものを選別するために、基質消費アッセイを利用した。基質消費アッセイは、GGDPより合成される炭素数40個の赤色カロテノイド、リコペンの合成遺伝子を導入した大腸菌に試験プラスミドを導入し、その翻訳産物と赤色カロテノイド合成系がGGDPを奪い合うことを利用した赤色着色で評価した。このスクリーニングにより選抜された活性を保持したクローンについて、組換えタンパク質を用いた試験管内変換実験を行い、GC-MSにより生成物を調べた結果、全てで変異導入前の野生型と同じ生成物パターンとなり、目的新規酵素創製は成功しなかった。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。