2012 Fiscal Year Annual Research Report
基質消費スクリーニングを用いたテルペン酵素の機能進化
Publicly Offered Research
| Project Area | Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification |
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| Project/Area Number |
23108507
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
梅野 太輔 千葉大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00400812)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | テルペン / 進化分子工学 / 代謝工学 / スクリーニング / 反応特異性 / カロテノイド / ランダム変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が開発したテルペン活性のスクリーニング法では、基質消費活性が高いほど、つまり細胞活性が高いほど「より白い」コロニを形成する。「白さ」を指標として、テルペン酵素の細胞活性をハイスループットに見積もることができる。これを用いて，以下２つの方向で実験を行った。
(1) タバコ由来5-epi-aristolochene（防カビ剤の前駆体）合成酵素(TEAS)，イチイ由来のタキサジエン（抗がん剤タキソールの前駆体）合成酵素（TaxS）を変異PCR法によってランダム変異 (～2変異/gene/世代)を導入し，ライブラリ化（多様化）した。つぎに，それぞれを黄色ブドウ球菌由来のC30カロテノイド合成経路とともにひとつの大腸菌内に発現させた。活性の無い酵素変異体の導入された大腸菌は，色素由来の黄色いコロニを与えたが，活性をもつ変異体を導入した細胞は，白っぽいコロニを与える。白いコロニから得た配列をサンプリングして解読したところ，ストップコドンやフレームシフト，そして重篤な構造破壊／機能低下をもたらす変異は完全に除去されていた。こうして，世界で初めて，テルペン酵素としての機能におけるMutability mapが描けることができるようになった。
(2) ゲラニオール酵素とTEASの２つの酵素について，ランダム変異→活性スクリーニング活性変異体を調べたところ，親よりも白いコロニーを幾つも得た。これらを解析したところ，細胞活性は有意に向上していたが，おもに異種発現性の向上によって説明できるものが殆どであった。
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| Research Progress Status |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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