2012 Fiscal Year Annual Research Report
放線菌での二次代謝系操作に適した新規ゲノム操作システムの構築
Publicly Offered Research
| Project Area | Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification |
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| Project/Area Number |
23108510
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
片岡 正和 信州大学, 工学部, 准教授 (90332676)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | 放線菌 / 微生物遺伝 / ゲノム進化 / 接合伝達 / SAP1 / 中間宿主 / 大腸菌 / 生合成マシナリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【SAP1のベクター化】では放線菌宿主の遺伝子改変、SAP1への組み込み部位の導入、SAP1ベクターシステムの開発を行った。Streptomyces avermitilis由来の巨大線状プラスミドSAP1をベクターとして扱う方法を開発した。SAP1上に部位特異的組換えサイトを持つSAP1を、接合伝達を利用して放線菌間で自在に動かすため宿主として利用予定のS, lividansゲノム上の組み込み部位を破壊した。作製した菌株にSAP1誘導体を接合伝達で導入し、中間宿主を作製した。この作製した中間宿主に大腸菌から接合伝達を利用して遺伝子を送り込み、送り込んだ遺伝子がSAP1上に設計どおりに組み込まれたことを確認した。この課程で、S. lividansが中間宿主として非常に高い能力を持つことを発見した。さらにクラブラン酸生合成遺伝子群やラクタスタチンの生合成遺伝子群を送り込み、SAP1上への組み込みを確認した。またクロラムフェニコール生合成遺伝子群をSAP1へ組み込み、S. lividansとS. avermitilisへ導入してその生産を確認した。さらにこれらのSAP1誘導体が大腸菌からの接合伝達効率の低い菌株へ高効率で伝達されることを明らかにした。
【接合伝達の応用】ではSAP1への高効率接合伝達能力の付与を目標にしていたが、 SAP1が持つ接合伝達システムを利用した。
【高速放線菌遺伝子群改変システムの樹立】ではS.lividansへ属間接合伝達で大型DNAを輸送する大腸菌宿主の改良を目的とした。初期型のRP-4システムをゲノムに組み込んだS17-1株ゲノム上のRP-4組み込み部位の構造を明らかにすると共に、scarless deletionという独特の手法でMu部位を除去した。さらに属間接合伝達の際の障壁であるDNAメチル化酵素の一つ、dcmも破壊した。
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| Research Progress Status |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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