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2011 Fiscal Year Annual Research Report

ALSの病態解明に向けたRNA結合蛋白質TDP-43及びFUSの網羅的機能解析

Publicly Offered Research

Project AreaDiversity and asymmetry achieved by RNA program
Project/Area Number 23112712
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

河原 行郎  大阪大学, 医学系研究科, 特任准教授(常勤) (80542563)

Keywords脳神経疾患 / RNA / 筋萎縮性側索硬化症 / 痴呆 / 遺伝子
Research Abstract

本研究では、ALSの病態と深く関連する二つのRNA結合蛋白質TDP-43とFUSそれぞれが持つRNA制御機能全体と、連携して果たす機能についての分子基盤情報を構築し、ALS病態の統合的解明へ役立てることを目的として研究を開始した。その結果、本年度は、下記のような成果を得た。すなわち、タグ付きのTDP-43及びFUSの二重安定発現細胞株を樹立した。この細胞を大量培養し、PAR-CLIP法を用いた免疫沈降法により、TDP-43およびFUSそれぞれに結合するRNA断片を回収した。また超大量培養後に両者に対する二重免疫沈降も行い、TDP-43/FUS複合体に結合するRNA断片も回収できるようになった。PAR-CLIP法は、微量なRNA断片をターゲットとするため、UVクロスリンクの強度、酵素中に含まれる微量な外因性RNAの混入、リンカーの精製精度など、樹立中様々な困難に直面したが、すべてを解決し安定的にライブラリーが構築できるようになった。その後、これらのRNA断片を用いてcDNAライブラリーを構築し、TAクローニング法により品質に問題がないことを確認した。現在、次世代シーケンサを用いたdeep sequenceを開始したところであり、来年度はその結果をもとに、両蛋白質に結合する転写産物の種類や数、結合部位、さらにはTからCへの置換部位を抽出することによって、それぞれの蛋白質が認識する配列を解析する予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PAR-CLIP法を用いたTDP-43及びFUSに結合するRNA断片の安定的な回収法の樹立に時間を要したが、この手法の樹立には時間がかかることをあらかじめ想定していた。現在は、シーケンスという次の段階に移行しており、ほぼ順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

来年度はdeep sequenceによって得られた結果をもとに、TDP-43及びFUSそれぞれに結合する転写産物の種類や数、結合部位、さらにはTからCへの置換部位を抽出することによって、それぞれの蛋白質が認識する配列を解析する予定である。さらにこれらの分子基盤情報をもとに、スプライシング部位近傍に結合していないかどうか、非翻訳領域のどの位置に結合しているかといった二次解析を行い、TDP-43とFUSそれぞれがどのようなRNA制御に関与するのか、その機能を予測する。更には、幾つかのターゲットを抽出して実験的検証を行う。

  • Research Products

    (3 results)

All 2012 2011 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] TDP-43 promotes microRNA biogenesis as a component of the Drosha and Dicer complexes2012

    • Author(s)
      河原行郎、佐藤愛
    • Journal Title

      米国科学アカデミー紀要

      Volume: 109(9) Pages: 3347-3352

    • DOI

      PMID:22323604

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] マイクロRNA2011

    • Author(s)
      河原行郎
    • Journal Title

      分子精神医学

      Volume: 11(3) Pages: 172-177

  • [Remarks]

    • URL

      http://apprentice.jpn.org/hp/research-kawahara.html

URL: 

Published: 2013-06-26  

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