2011 Fiscal Year Annual Research Report
異常終止コドン認識複合体の構造機能解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Diversity and asymmetry achieved by RNA program |
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| Project/Area Number |
23112718
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
山下 暁朗 横浜市立大学, 医学部, 講師 (20405020)
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| Keywords | NMD / mRNA分解 / mRNA代謝 / 翻訳終結 |
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| Research Abstract |
クライオ電子顕微鏡法による異常終止コドン認識複合体の立体構造解析
H23年度は、これまでの分子機構研究の課程で明らかとした、「異常終止コドンを識別している分子複合体」の立体構造をクライオ電子顕微鏡法を用いて解析するため、動物細胞からのタンパク質複合体大量精製系の改善を行った。
a)クライオ電子顕微鏡法に用いるタンパク質複合体の精製
これまでの解析により、異常終止コドン識別複合体は、ribosome,eEF2,eRF1,eRF3,Upf1,SMG-1,SMG-8,SMG-9,Upf2,Upf3,エクソンジャンクション複合体、mRNAにより構成されていることを明らかにしている。本研究では、これら構成成分を精製し、試験管内での再構成を試みる。この目的のため、異常終止コドン識別複合体構成分子のうち、SMG-1(430kDa),SMG-8(130kDa),SMG-9(60kDa),Upf1(140kDa),Upf2(165kDa),Upf3b(60kDa)に関し、動物細胞を用いたタンパク質大量精製系を用い精製をおこなった。いくつかの分子については、十分な発現がみられなかったため、動物細胞発現ベクターの改善を行った。具体的には従来のベクターに、翻訳促進配列、mRNA安定化配列を追加し、さらに、人工遺伝子合成によルコドン最適化を行った。これらの改善により、SMG-8について、従来に比べ50倍以上の発現量上昇に成功した。今後他の分子についても、発現量の改善を進めていく。
b)異常終止コドンを識別している分子複合体構成因子の分子間相互作用の解析
Upf2について、eRF3結合領域の同定を進めている。現在までにUpf3bが競合的にUpf2に結合することを明らかとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
動物細胞高発現ベクターの改良に成功したことにより、蛋白精製に関わるコストを劇的に引き下げることに成功した。これにより当初の計画以上のトライアル実験が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cryo-EMによる構造解析が順調に進んでいるため、これに集中する。また、人工遺伝子合成にるコドン最適化により発現量の大幅な上昇が確認できたため、動物細胞を用いたタンパク質大量精製により、結晶構造解析が可能な涼を得ることが可能か解析を行う。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] A novel role for hSMG-1 in stress granule formation2011
Author(s)
Brown JA, Roberts TL, Richards R, Woods R, Birrell G, Lim YC, Ohno S, Yamashita A, Abraham RT, Gueven N, Lavin MF
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Journal Title
Mol Cell Biol
Volume: 22
Pages: 4417-4429
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Mutations in POLR3A and POLR3B encoding RNA Polymerase III subunits cause an autosomal-recessive hypomyelinating leukoencephalopathy2011
Author(s)
Saitsu H, Osaka H, Sasaki M, Takanashi J, Hamada K, Yamashita A, Shibayama H, Shiina M, Kondo Y, Nishiyama K, Tsurusaki Y, Miyake N, Doi H, Ogata K, Inoue K, Matsumoto N
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Journal Title
Am J Hum Genet
Volume: 89
Pages: 644-651
DOI
Peer Reviewed
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