2011 Fiscal Year Annual Research Report
ポリグルタミン酸化修飾イメージングの基盤技術開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation |
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| Project/Area Number |
23117517
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
池上 浩司 浜松医科大学, 医学部, 助教 (20399687)
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| Keywords | 翻訳後修飾 / 微小管 / チューブリン / イメージング / 抗体 / 質量分析 |
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| Research Abstract |
当該年度実施項目1)修飾特異的認識プローブの探索、2)チューブリンC末端被修飾領域の直接イメージングに向けた諸条件検討、について以下の成果を得た。
1)修飾を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成し、抗体産生ハイブリドーマより免疫グロブリン重鎖、軽鎖双方の可変領域をクローニングした。DNA配列を解読した後、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結し、さらにその下流に蛍光タンパク質を連結することで蛍光ScFv発現ベクターを構築した。最後に、細胞株において作成した蛍光ScFvを発現できることを確認した。これらの成果を領域シンポジウムにて発表した。これに加え、蛍光タンパク質の細胞内拡散を可視化する技術と修飾シグナル制御研究を融合させ、シンガポールにて招待講演として発表した。本年度の成果は修飾ライブイメージングの基盤となる点で非常に大きな意義がある。
2)チューブリンC末端被修飾領域の直接イメージングに向けた条件検討を行った。精製チューブリンと合成チューブリンC末端ペプチドを混合し、各種ペプチダーゼで処理した後、質量分析計による検出を試みた。チューブリンと合成ペプチドのモル比が20:1程度の条件で辛うじて合成ペプチドを検出できた。チューブリンC末端の多様性(数十種類)およびペプチダーゼによる切断効率を考慮すると、現条件では質量分析計による直接検出は難しいことが分かった。今後更なる改良が必要であるという指針を明示できた点で非常に有意義である。他方、別途実施した原子間力顕微鏡によるチューブリンC末端の検出に成功し、成果をBiophysical Journal誌に発表した。チューブリンC末端の修飾イメージングに繋がる点で非常に重要な成果である。
これらに加え、将来的に上記イメージング技術の利用が見込まれる『修飾シグナル病』の例として、ポリグルタミン酸化修飾制御異常による病態発症に関する知見2件を学術雑誌に報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
チューブリンC末端翻訳後修飾のイメージングに向けた基盤技術を開発するという本研究の目的に対し、多面的にアプローチし、ライブイメージングに向けたプローブの作成、直接質量分析法の可否の評価に加え、原子間力顕微鏡によるチューブリンC末端の可視化に成功し、その成果を学術雑誌に発表した。更に、将来的なイメージング技術の利用を見据え、修飾制御異常による病態発症に関する報告を学術雑誌に発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
修飾の直接イメージングに向けた基盤技術開発については、原子間力顕微鏡によるチューブリンC末端の可視化に成功したことで当初目的をある程度達成できた。今後は修飾のライブイメージングを目指して、研究を推進する。作成したチューブリンC末端翻訳後修飾に対する蛍光ScFvを安定的に発現する細胞株を作成する。蛍光タンパク質の安定発現系構築では遺伝子サイレンシングがしばしば問題になるが、この問題に直面した場合insulatorという特殊なDNA配列を利用することで問題解決を図る。作成した蛍光ScFv安定発現細胞株に対し、チューブリンC末端翻訳後修飾酵素を共発現させ、翻訳後修飾のライブイメージングの可否を評価する。更に、修飾異常を示すモデルに蛍光ScFvを発現させ、修飾の正常と異常を生きたまま可視化できるか検討する。
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[Journal Article] CEP41 is mutated in Joubert syndrome and is required for tubulin glutamylation at the cilium2012
Author(s)
Lee JE, Silhavy JL, Zaki MS, Schroth J, Bielas SL, Marsh SE, Olvera J, Brancati F, Iannicelli M, Ikegami K, Schlossman AM, Merriman B, Attie-Bitach T, Logan CV, Glass IA, Cluckey A, Louie CM, Lee JH, Raynes HR, Rapin I, Castroviejo IP, Setou M, Barbot C, Boltshauser E, Nelson SF, Hildebrandt F, Johnson CA, Doherty DA, Valente EM, Gleeson JG
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Journal Title
Nat Genet
Volume: 44
Pages: 193-199
DOI
Peer Reviewed
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