2011 Fiscal Year Annual Research Report
無細胞蛋白質アレイを基盤とした細胞がん化E3リガーゼの網羅的同定と解析
Publicly Offered Research
Project Area | Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation |
Project/Area Number |
23117524
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Research Institution | Ehime University |
Principal Investigator |
澤崎 達也 愛媛大学, 無細胞生命科学工学研究センター, 准教授 (50314969)
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Keywords | E3リガーゼ / 無細胞タンパク質合成 / がん抑制タンパク質 / ユビキチン化 / RING / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / p53 |
Research Abstract |
I. ビオチン化RING-type E3リガーゼプロテインアレイの作製 既に完成している152種類のRING-type E3リガーゼに加えて、申請者らが既に保有している1万5千種類のヒト完全長cDNAライブラリーを用いて、予測された約200種類のRING-type E3リガーゼ遺伝子のcDNAクローンを選択した。それらcDNAクローンから、スプリットPCR法により転写・翻訳用の鋳型を作製し、N末端にビオチン化した組換えプロテインアレイを合成し、現在、224種類のRING-type E3リガーゼプロテインアレイを構築することに成功し、超低温フリーザーに保存している。 II. アルファスクリーン法によるがん化抑制因子および促進因子と結合するE3リガーゼ分子の同定 上記で作成したビオチン化E3リガーゼプロテインアレイを、コムギ無細胞系で合成したFlagタグをN末端に付加した4種類のがん促進蛋白質(p53、LKB1、CYLD、PTEN)と結合するE3リガーゼのスクリーニングを行った。相互作用の検出方法には、アルファスクリーン法を利用した。その結果、それぞれのがん抑制蛋白質と相互作用するE3リガーゼを2~3種類同定することに成功した。また、その一部に関しては、in vitroでのE3リガーゼ依存的なユビキチン化が起こることを明らかとした。この事は、本スクリーニングシステムが基質特異的なE3リガーゼの探索・同定に有効であることを示している。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画どおりにプロテインアレイの構築に成功し、それらを用いたがん抑制蛋白質を特異的にユビキチン化するE3リガーゼの同定に成功しているため。
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Strategy for Future Research Activity |
今後は、新たに同定したE3リガーゼの細胞内でのユビキチン化の確認を行う。
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Research Products
(15 results)