2012 Fiscal Year Annual Research Report
アクチンフィラメントのB端方向への協同的構造変化とハイパーモバイル水の機能解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Water plays a key role in ATP hydrolysis and ATP-driven functions of proteins |
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| Project/Area Number |
23118721
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
上田 太郎 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究部門付 (90356551)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | アクチンフィラメント / ミオシン / 協同的構造変化 / 運動 |
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| Research Abstract |
目的1(ミオシン結合により誘起されるアクチンフィラメントの一方向的な構造変化の検出):昨年度までに、アクチンとS1のキメラタンパク質とピレン標識した正常アクチンのブロック共重合体を作製し、ATPを添加したときのピレン蛍光強度の変化をモニターすることで、キメラタンパク質に起きた構造変化が、P端側に隣接するアクチンに伝播することを見出していた。しかし蛍光強度の変化幅が小さく、説得力に乏しいことが問題であった。変化幅が小さいのは、大量に混入するピレン標識アクチンのホモフィラメントの蛍光が大きいためだと考えられたので、今年度は、ピレン標識アクチンのホモフィラメントの分離除去を試みたが、おもわしい成果が得られなかった。そこで方針を大きく変更し、ミオシンの結合しやすさを指標にアクチンフィラメントの一方向的な構造変化を検出することとした。この場合は、電子顕微鏡または高速AFMによる検出となるので、ブロックコポリマーを精製する必要はない点が有利である。電子顕微鏡を用いた予備実験により、キメラタンパク質のホモポリマーブロックの両側に正常アクチンを重合させたブロックコポリマーがある程度生成され条件を確立した。
目的2(キメラタンパク質と正常アクチンが互いに共重合しにくい現象のメカニズム解明):昨年度までは、Alexa488とAlexa594という二つの蛍光色素で標識されたキメラタンパク質と正常アクチンの共重合を蛍光顕微鏡で観察し、二つの蛍光がフィラメント中で均一に混ざり合わないことから、キメラタンパク質内のアクチンは、正常アクチンとは異なる構造をとるのだろうと推測していた。しかし今年度の研究により、Alexa594にはタンパク質を凝集させる傾向があることが判明し、蛍光の不均一性はAlexa594の人工産物である可能性が排除できなくなった。今後は別の蛍光色素を用いて実験する必要がある。
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[Journal Article] G146V mutation at the hinge region of actin reveals a myosin class-specific requirement of actin conformations for motility.2012
Author(s)
Noguchi, T. Q. P., Komori, T., Umeki, N., Demizu, N., Ito, K., Iwane, A. H., Tokuraku, K., Yanagida, T., Uyeda, T. Q. P.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 279
Pages: 24399-34345
DOI
Peer Reviewed
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