カルビンサイクル調節システムの構造基盤

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 23121519
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松村 浩由 大阪大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (30324809)
• Keywords: カルビンサイクル / 光調節 / CP12-GAPDH複合体

Research Abstract

本研究では、カルビンサイクル調節タンパク質CP12との複合体であるGADPH-CP12、GAPDH-CP12-PRK、ならびにPRKの立体構造をX線構造解析法によって決定し、これら複合体形成によるGAPDH、PRKの阻害メカニズム、すなわち、カルビンサイクル調節メカニズムを明らかにすること、ならびに、"Intrinsically Unstructured Protein"であるCP12の段階的折り畳みメカニズムを解明する予定である。
平成23年度は、GAPDH-CP12複合体を中心にその結晶化とX線構造解析を行った。Synecococcus由来GAPDHとCP12をそれぞれ組み替え大腸菌で大量生産し、Niアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製を行った。得られた高純度のGAPDHとCP12を用いて、GAPDH-CP12複合体の結晶化を行った。恒温インキュベータ(20℃と4℃)で、種々の結晶化条件の検討を行ったところ、PEG3350を沈殿剤として用いた条件で、0.2x0.2x0.1mm程度のX線回折実験に適した大きさの単結晶を作成することに成功した。大型放射光施設にてX線回折実験を行ったところ回折能2.2A分解能を示し、構造解析に成功した。GAPDH-CP12複合体の構造解析から、CP12のC末端部分(Thr53-Asp75)のみがGAPDHと結合して立体構造を形成し、その他の部分は特定の立体構造を持たないことが分かった。また、CP12はジスルフィド結合を有し、同時にNADとも結合していたことから、GAPDHとの結合にCP12の酸化とNADが必須である理由が明らかとなった。GAPDHの基質結合部位はCP12によってふさがれ、GAPDHは基質に結合できない状態にあったため、CP12によってGAPDH活性が阻害されるメカニズムが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

通常、結晶化が困難とされるIntrinsically Unstructured Proteinを結晶化するにあたって、新たなタンパク質結晶化技術を適用し、GAPDH-CP12複合体の結晶を作製することができた。さらに、構造解析にも成功し、そのメカニズム解明に迫ることができ、計画どおりおおむね順調に研究が進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、今後、PRKの構造解析ならびに、さらなる複合体の構造解析に取り組むことによって、カルビンサイクル調節メカニズムを明らかにすること、ならびに、"Intrinsically Unstructured Protein"であるCP12の段階的折り畳みメカニズムを解明する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Structure basis for the regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydro genase activity via the intrinsically disordered protein CP12 (2011)
  • Author(s): H.Matsumura, A.Kai, T.Maeda, M.Tamoi, A.Satoh, H.Tamura, M.Hirose, T.Ogawa, N.Kizu, A.Wadano, T.Inoue, S.Shigeoka
  • Journal Title: Structure Volume: 19 Pages: 1846-1854
  • DOI: DOI:10.1016/j.str.2011.08.016
  • Peer Reviewed