2013 Fiscal Year Annual Research Report
天然変性タンパク質ｐ５３の一分子構造・構造揺らぎ解析法の開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Target recognition and expression mechanism of intrinsically disordered protein |
|---|
| Project/Area Number |
24113701
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
鎌形 清人 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (90432492)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
|
| Keywords | 天然変性タンパク質 / 一分子計測 / p53 / DNA / 蛍光顕微鏡 |
|---|
| Research Abstract |
がん抑制蛋白質p53の基質認識機構を明らかにするため、p53がDNA上のターゲット配列を探索する運動の観測を行った。まず、p53を作製する実験系の最適化を行った。大腸菌を用いて、GSTと融合させたp53を発現させ、GSTカラムを利用しp53を精製した。この蛋白質は凝集しやすいことが知られており、活性のあるサンプルを得ることは難しいとされている。凝集しにくい変異体の作製、培養や精製の条件や方法の検討、複数のDNA結合や会合体解析を行い、4量体で活性のあるサンプルを得る方法を確立した。
次に、p53は、DNAから離れることなくターゲット配列を滑るように探索できる。全反射蛍光顕微鏡を作製し、蛍光色素修飾したp53単分子のスライディング運動を直接観測した。その結果、p53はDNA上でスライディング運動の速さを変えながらターゲット配列を探索することが明らかとなった。これは、p53の構造変化に伴い、p53とDNAの結合様式が変わることで、スライディング時のDNAへの結合の強さが変化するためであると考えられる。
上記の方法では、引き伸ばされた直線状DNA上でのp53の探索運動しか観測することはできない。一方、細胞内ではDNAは核内で“収縮”しているため、引き伸ばされたDNA上とは異なる探索運動が行われている可能性がある。そこで、フロー圧を制御し、収縮したDNA上の蛋白質の位置を追跡する方法を開発した。この方法を用いて、収縮したDNA上でp53の探索過程を観測したところ、スライディング運動の他に、DNAのある部位から別の部位へジャンプする現象が観測された。p53は生体内でDNA上に存在するヒストンや他のDNA結合蛋白質などの障害物をジャンプすることで回避していると考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Reason
25年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
|
-
[Journal Article] Microsecond dynamics of an unfolded protein by a line confocal tracking of single molecule fluorescence2013
Author(s)
Oikawa, H., Suzuki, Y., Saito, M., Kamagata, K., Arai, M., Takahashi S.
-
Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 3
Pages: 2151
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
