染色体の核内高次構築を支配する非コード領域とそれを制御するタンパク質の解析

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Functions of non-coding DNA region for genome integrity
• Project/Area Number: 24114520
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 基盤技術センター長 (40229349)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 複製起点 / 複製タイミング / クロマチンループ / Rif1タンパク質 / Cdc7キナーゼ / pre-RC / 複製ストレス / チェックポイント応答

Outline of Annual Research Achievements

染色体は核内で、機能ドメインに区分され、コンパクトにパッケージ収納されると考えられる。しかし、この染色体の機能ドメイン形成と核内染色体高次構築の制御機構とその核機能制御における役割は大部分不明である。最近の研究から、染色体複製のタイミングを規定する複製タイミングドメインは、細胞ごとに特有のパターンを示すゲノムワイドのエピゲノム情報であり、そのパターンは、染色体の機能ドメインと密接に関連していることが明らかになりつつある。私たちは分裂酵母の遺伝学的解析から複製起点の活性化のパターンを制御する因子を複数同定した。その中のひとつテロメア結合因子Rif1は分裂酵母の複製開始部位の選択とタイミングの制御に深く関与することを発見した。ヒトRif1ホモログは、テロメア制御には関与しないが、その発現抑制により、複製タイミングドメインがゲノムワイドで大きく変動することを見出した。特にS期中期の複製タイミングドメインが特異的に消失する(図)。又、Rif1はM期後期/G1初期にクロマチンのDNaseI不溶性画分に結合し、そのパターンはS期中期の複製fociと共局在する。さらに、Rif1はクロマチンループサイズを制御する。上記の結果から、Rif1は、クロマチンループの形成を介してS期中期の複製タイミングドメインを規定すると結論した。又、Rif1はES細胞で大量に発現され、分化誘導と共に急激に減少する。Rif1欠損MEF細胞ではiPSの生成効率が減少する。Rif1結合部位は分裂酵母ではRif1は複製起点とは重複しないが制御する起点の近傍に結合し、多くの場合複製起点活性化を抑制する。Rif1により抑制される複製起点約200個のうち50%は、チェックポイントによっては抑制されない。Rif1は細胞周期特異的なリン酸化を受ける。また膜画分に結合する。精製Rif1タンパクはDNA結合能を有する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度酵母とヒトのRif1については論文として発表し、ゲノム的アプローチ、nformaticsによる解析、生化学的アプローチ、細胞レベルでの解析、発生工学的アプローチ、など種々のアプローチを駆使して　分裂酵母および動物細胞のRiif1の機能解析を通じて、非コード領域の機能解析に新たな知見を得るための基盤を作る事ができた。

Strategy for Future Research Activity

1) Rif1が染色体の非コード領域との相互作用を介して、いかにクロマチンループの形成を制御するか、2) これが複製、組換え、転写等の染色体タイナミクスを制御するメカニズム、3) Rif1機能の細胞周期制御、4) Rif1の未分化能維持における役割、5) 組織、臓器の発生の過程でのRif1の機能、などの解析を通じて、Rif1による核内染色体構築とその生物学的意義について解明したい。

ヒトおよびマウスのRIf1のゲノムワイド結合部位の解析、ChIA-PETによるクロマチンネットワークの解析、リン酸化部位の同定とその意義の解析、ノックアウトマウスの解析による個体、臓器、組織レベルでの機能解析、精製タンパクの機能、形態の解析、分裂酵母Rif1変異株、増産株を用いた新規Rif1機能制御分子の同定と解析、イメージングによるRif1の核内動態解析などが　推進課題となる。

Research Products

• [Journal Article] The Human Tim/Tipin Complex Directly Interacts with DNA Polymerase {epsilon} and Stimulates its Synthetic Activity. (2013)
  • Author(s): Aria, V., De Felice, M., Di Perna, R., Uno, S., Masai, H., Syvaoja, J.E., van Loon, B., Hubscher, U. and *Pisani, F.M.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 288 Pages: 12742-12752
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.398073.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A personal reflection on the Replicon Theory: from R1 plasmid to replication timing regulation in human cells (2013)
  • Author(s): Masai, H.
  • Journal Title: J. Mol. Biol. Volume: 425 Pages: 4663-4672
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2013.03.039.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Replication timing regulation of eukaryotic replicons: Rif1 as a global regulator of replication timing. (2013)
  • Author(s): Yamazaki, S. Hayano, M. and Masai, H.
  • Journal Title: Trends in Genetics Volume: In press Pages: In press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition of DNA damage-induced apoptosis through Cdc7-mediated stabilization of Tob. (2012)
  • Author(s): Suzuki, T., Tsuzuku, J., Hayashi, A., Shiomi, Y., Iwanari, H., Mochizuki, Y., Hamakubo, T., Kodama, T., Nishitani, H., Masai, H. and Yamamoto, T.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 287 Pages: 40256-40265
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.353805.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A central coupler for recombination initiation linking chromosome architecture to S-phase checkpoint. (2012)
  • Author(s): Miyoshi, T., Kugou, K., Yamada, S., Ito, M., Furuichi, M., Oda, A., Hirota, K. and Masai, H. and Ohta, K.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 47 Pages: 722-733
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2012.06.023.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Regulation of DNA replication timing on human chromosome by a cell-type specific DNA binding protein SATB1. (2012)
  • Author(s): Oda, M., Kanoh, Y., Watanabe, Y., and Masai, H.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 7 Pages: 214-221
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0042375.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Purification of replication factors using insect and mammalian cell expression systems. (2012)
  • Author(s): Uno, S., You, Z., and Masai, H.
  • Journal Title: Methods Volume: 57 Pages: 214-221
  • DOI: 10.1016/j.ymeth.2012.06.016.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rif1 is a global regulator of timing of replication origin firing in fission yeast. (2012)
  • Author(s): Hayano, M., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Shrahige, K. and Masai, H.
  • Journal Title: Genes and Development Volume: 26 Pages: 137-150
  • DOI: 10.1101/gad.178491.111.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rif1 protein is a key regulator of the genome-wide DNA replication timing in human cells. (2012)
  • Author(s): Yamazaki, S., Ishii, A., Kanoh, Y., Oda, M., Nishito, Y. and Masai, H.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 31 Pages: 3167-3177
  • DOI: 10.1038/emboj.2012.180.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] c-Jun N-terminal Kinase (JNK)-Mediated Rad18 Phosphorylation Facilitates Polη Recruitment to Stalled Replication Forks. (2012)
  • Author(s): Barkley, L.R., Palle, K., Durando, M., Day, T.A., Gurkar, A., Kakusho, N., Li, J., Masai, H., Vaziri, C.
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell. Volume: 23 Pages: 1943-1954
  • DOI: 10.1091/mbc.E11-10-0829.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] EBNA1-dependent recruitment of Orc on OriP of Epstein-Barr virus with purified proteins: Stimulation by Cdc6 through Its direct interaction with EBNA1. (2012)
  • Author(s): Moriyama, K., Yoshizawa-Sugata, N., Obuse, C., Tsurimoto, T. and Masai, H.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 287 Pages: 23977-23994
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.368456.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mechanism of cancer cell death induced by depletion of an essential replication regulator. (2012)
  • Author(s): Ito, S., Ishii, A., Kakusho, N., Taniyama, C., Yamazaki, S., Sakaue-Sawano, A., Miyawaki, A., and Masai, H.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 7 Pages: e36372
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0036372.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] テロメア結合因子Rif1は、染色体複タイミングを決定する (2012)
  • Author(s): 早野元詞、加納豊、松本清治、正井久雄
  • Journal Title: 細胞工学 Volume: 31 Pages: 460-462
• [Journal Article] Rif1タンパク質はヒトゲノム複製タイミングドメインを決定する。 (2012)
  • Author(s): 山崎 聡志、正井 久雄
  • Journal Title: 実験医学、Current Topics Volume: 30 Pages: 2974-2978
• [Presentation] A personal reflection on the Replicon Theory: from R1 plasmid to replication timing regulation in human cells (2013)
  • Author(s): Hisao Masai
  • Organizer: Half a Century With Replicon Theory for Genome Stability and Instability
  • Place of Presentation: Pasteur Institute, Paris, France
  • Year and Date: 2013-03-25 – 2013-03-28
  • Invited
• [Presentation] Cell cycle and chromatin regulators in stem cell regulation (2013)
  • Author(s): Hisao Masai
  • Organizer: The Gene and Immnuotherapy conference
  • Place of Presentation: Ho chi Min City, Vietnam
  • Year and Date: 2013-03-21 – 2013-03-22
  • Invited
• [Presentation] 解体再構成的アプローチから合成生物学#8226;生命現象シミュレーションへ：DNA複製をモデルとして (2012)
  • Author(s): 正井久雄
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会 シンポジウム
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2012-12-14 – 2012-12-16
  • Invited
• [Presentation] Regulation of replication fork in maintenance of genomic integrity (2012)
  • Author(s): Hisao Masai
  • Organizer: 15th A-IMBN Annual Conference
  • Place of Presentation: Shanghai
  • Year and Date: 2012-10-23 – 2012-10-23
  • Invited
• [Presentation] Cell cycle regulation of mouse embryonic stem cells: E2F- and Emi1-mediated positive feedback regulation. (2012)
  • Author(s): Hisao Masai
  • Organizer: 4th Southeast Stem Cell Consortium Workshop at Florida State University
  • Place of Presentation: Tallahassee, Florida
  • Year and Date: 2012-09-28 – 2012-09-29
  • Invited