2012 Fiscal Year Annual Research Report
「数」を視点とした走光性信号伝達過程における信号増幅機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Spying minority in biological phenomena -Toward bridging dynamics between individual and ensemble processes- |
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| Project/Area Number |
24115508
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
井上 圭一 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90467001)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 一分子観察 / ロドプシン / Cheタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究計画初年度の当たる平成24年度はセンサリーロドプシンＩ、トランスデューサータンパク質、Cheタンパク質の間の信号伝達過程の一分子観察のための全反射顕微鏡観測系の構築を主として行った。
そのためにまず浜松ホトニクス社製のデュアルCCDカメラを導入し、それを用いて、蛍光色素によって染色されたロドプシンの一分子観察を試みた。この時観察光による不必要なロドプシンの光励起を避けるため、ロドプシンよりも長波長に吸収を持つDyLight650色素を観察に用いた。そしてDyLight650を結合させるため、システイン残基を導入したロドプシンを再構成し、スライドガラス上に固定し観察を試みたところ、一分子からの蛍光を得ることに成功した。従って観察系の構築は研究計画通り完了したため、今後はこれを用いた信号伝達過程の一分子観察を行っていく。
一方センサリーロドプシンＩとトランスデューサーを脂質二重膜に再構成した条件で両分子間の相互作用が正常に行われている事を確認するため、過渡吸収測定を行った。本来センサリーロドプシンＩのみの場合は光反応サイクルの速度がpHに依存し、高pH側で速度が遅くなることが知られている。それに対し生体内でトランスデューサーと複合体を形成した場合はpH依存性が無くなり、常に同じサイクル速度を示す事が分かっている。そこで今回独立に発現させたセンサリーロドプシンＩとトランスデューサーを１：１の割合で混合し、光反応サイクルの観測を行ったところ、まだフォトサイクルのpH依存性が見られた。このことから今後再構成系で相互作用過程を観察する際には過剰量のトランスデューサーを加える必要がある事が明らかになった。
本年度においては２件の論文発表の他、２２件の学会発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は一分子観察用の顕微鏡の構築を完了し、それを用いた色素染色されたロドプシンの一分子観察にも成功した。またセンサリーロドプシンＩおよびトランスデューサーの発言系の構築も完了し、今後は相互作用する条件検討を行った後、実際に信号伝達過程の観測を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度に当たる平成25年度はセンサリーロドプシンＩやトランスデューサー、Cheタンパク質にラベリング用のシステインを導入した変異体を作製し、その間のＦＲＥＴ観察を行うことで、信号伝達過程の解明を目指す。
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| Remarks |
本研究の成果について３件の新聞報道が行われたことをここに特記する。
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[Journal Article] Hayato Yamashita, Keiichi Inoue, Mikihiro Shibata, Takayuki Uchihashi, Jun Sasaki, Hideki Kandori, Toshio Ando2013
Author(s)
Hayato Yamashita, Keiichi Inoue, Mikihiro Shibata, Takayuki Uchihashi, Jun Sasaki, Hideki Kandori, Toshio Ando
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Journal Title
Journal of Structural Biology
Volume: in press
Pages: in press
Peer Reviewed
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