2012 Fiscal Year Annual Research Report
真核系無細胞翻訳システムを利用したｓｈｕｎｔｉｎｇ基盤人工リボスイッチの開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks |
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| Project/Area Number |
24119510
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
小川 敦司 愛媛大学, 学内共同利用施設等, 講師 (30442940)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | リボスイッチ / アプタマー / 合成生物学 / shunting |
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| Outline of Annual Research Achievements |
『特定の分子が存在する時にのみ、特定の遺伝子の発現が抑制あるいは促進されるシステム』を任意の分子に対して合理的に構築することができれば、合成生物学の基盤技術として有力なツールとなりうる。このようなシステムのモデルとしては、近年原核生物で発見された分子応答性遺伝子発現制御RNA『リボスイッチ』が有力候補としてあげられる。リボスイッチは、分子結合部位（アプタマー）および遺伝子発現制御部位から成っているが、任意分子に結合する人工アプタマーはin vitro selection法により獲得できるため、その人工アプタマーを用いれば、任意分子に応答する人工リボスイッチが構築できると考えられる。しかし、真核系においては、リボソームがmRNAの5'末端から進入するという翻訳システムの特徴のため、アプタマー基盤の促進型（ON）リボスイッチの人工構築は困難であった。そこで、本研究では、5'末端依存翻訳における内部リボソーム進入機構である『shunting』を利用することによって、真核系で働く人工ONリボスイッチの合理的構築を目指すことにした。shunting機構を利用してリボスイッチを構築するためには、高効率でshuntingを引き起こす必要がある。そこで、比較的効率の良いshuntingが確認されているカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のmRNAを、より高効率になるよう最適化することから始めた。具体的には、CaMVのmRNA配列からshuntingに必要な部位を抽出し、さらに部分的な配列の改変を行うことによって、野生型の約2.5倍のshuntingを引き起こす配列を獲得した。さらに、shuntingに必要な部位のうち、アプタマーに置き換えるのに最適な部分を調査し、実際にテオフィリンアプタマーを導入したところ、テオフィリン依存性の「真核系人工ONリボスイッチ」が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の１年目の目標は、「比較的効率の良いshuntingが確認されているカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のmRNAを、より高効率になるよう最適化する」ことであったが、その目標を超えて、さらに人工リボスイッチのプロトタイプ調製まで達成したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記のテオフィリン依存性リボスイッチのプロトタイプを合理的に最適化し、その過程で確立した設計戦略を他のアプタマー/リガンドペアでも試すことによって、汎用的な人工リボスイッチ設計法を導出する。
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