細胞運動時のアクチン過渡的複合体ダイナミクスの可視化解析

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states.
• Project/Area Number: 24121702
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 水野 健作 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (70128396)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 細胞・組織 / 細胞骨格 / 細胞運動 / アクチン / 蛍光イメージング

Outline of Annual Research Achievements

アクチン骨格の再編成は細胞の運動、形態形成、分裂など細胞の動的活動において中心的役割を担っている。細胞内においてアクチン骨格はアクチン繊維と多様なアクチン結合蛋白質から構成される過渡的複合体として存在しており、細胞はこの複合体の形成と崩壊を時空間的に制御することによって運動、形態形成などの動的な活動を行っている。生細胞内のアクチンの重合・脱重合の動態をリアルタイムに可視化、定量化することはこれまで困難であったが、私達は、可逆的な光活性化蛍光蛋白質Dronpaを用いて、生細胞内の局所における単量体G-アクチン濃度の経時的変化を定量的に測定する新技術s-FDAP (sequential fluorescence decay after photoactivation)法の開発に成功した。本研究では、蛍光の減衰を11回のtime pointで測定する手法を開発し、より高感度で精密なG-アクチン濃度変化の測定に成功した。この手法を用いて、メカニカルストレスによって細胞内G-アクチン濃度が急速に上昇することを明らかにした(Nat. Cell Biol., 2013)。また、蛋白質の複合体形成を高感度で検出するための新たなBimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)プローブを開発し、これを用いて、コフィリンとアクチンの結合を阻害する低分子化合物としてサイトカラシンDを同定した(BBRC, 2012)。さらに、血清刺激による乳癌細胞の遊走において、アクチン繊維に富むラメリポディアとよばれる過渡的複合体が形成されるが、ラメリポディアを先導端一方向に形成するのに必要なRho-GEFとして、p63Rho-GEFを同定した(FEBS Lett., 2012)。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

生細胞内のアクチン単量体濃度の時間的、空間的変化を解析するイメージング技術、連続FDAP法と多点FDAP法の開発に成功した。本年度は、s-FDAP法を改良し、より高感度、高精度で生細胞内のアクチン単量体濃度を測定することが可能となり、メカニカルストレスによる細胞内のアクチン単量体濃度の急速な上昇を示すことができた。さらに、蛋白質間相互作用を検出するプローブを開発し、蛋白質間相互作用の阻害剤のスクリーニングに活用し、阻害剤の同定に成功した。また、ラメリポディアというアクチン過渡的複合体形成に関わるシグナル分子としてp63RhoGEFの同定にも成功した。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、s-FDAP法や多点FDAP法をアクチン結合蛋白質や微小管など他の細胞骨格、細胞膜結合因子に応用することを計画している。また、BiFC法を用いたコフィリンーアクチン複合体の高感度検出システムを用いて、コフィリンリン酸化酵素であるLIMキナーゼの阻害剤を探索することも計画している。これらの手法で得られた結果に基づいて、細胞運動、形態形成、極性形成におけるアクチン過渡的複合体の形成機構と機能を解明することが今後推進すべき課題である。

Research Products

• [Journal Article] Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. (2013)
  • Author(s): Mizuno, K.
  • Journal Title: Cell. Signal. Volume: 25 Pages: 457-469
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2012.11.001.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] p63RhoGEF-mediated formation of a single polarized lamellipodium is required for chemotactic migration of breast carcinoma cells. (2013)
  • Author(s): Hayashi, A., Hiatari, R., Tsuji, T., Ohashi, K., and Mizuno, K.
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 587 Pages: 698-705
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.01.043.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NDR2-mediated Rabin8 phosphorylation is crucial for ciliogenesis by switching binding specificity from phosphatidylserine to Sec15. (2013)
  • Author(s): Chiba, S., Amagai, Y., Homma, Y., Fukuda, M., and Mizuno, K.
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 32 Pages: 874-885
  • DOI: 10.1038/emboj.2013.32.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] F- and G-actin homeostasis regulates mechanosensitive actin nucleation by formins. (2013)
  • Author(s): Higashida, C., Kiuchi, T., Akiba, Y., Mizuno, H., Maruoka, M., Narumiya, S., Mizuno, K., and Watanabe, N.
  • Journal Title: Nat. Cell Biol. Volume: 15 Pages: 395-405
  • DOI: 10.1038/ncb2693.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] CaMKIIbeta-mediated LIM-kinase activation plays a crucial role in BDNF-induced neuritogenesis. (2013)
  • Author(s): Saito, A., Miyajima, K., Akatsuka, J., Kondo, H., Mashiko, T., Kiuchi, T., Ohashi, K., and Mizuno, K.
  • Journal Title: Genes Cells Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1111/gtc.12054
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Coactosin accelerates cell dynamism by promoting actin polymerization. (2013)
  • Author(s): Hou, X., Katahira, T., Ohashi, K., Mizuno, K., Sugiyama, S, and Nakamura, H.
  • Journal Title: Dev. Biol. Volume: in press Pages: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] beta-arrestin-dependent regulation of the cofilin pathway is required for the scavenging activity of the atypical chemokine receptor D6. (2013)
  • Author(s): Borroni, E. M., Cancellieri, C., Vacchini, A., Benureau, Y., Lagane, B., Bachelerie, F., Arenzana-Seisdedos, F., Mizuno, K., Mantovani, A., Bonecchi, R., and Locati, M.
  • Journal Title: Sci. Signal. Volume: in press Pages: in press
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cytochalasin D acts as an inhibitor of the actin-cofilin interaction. (2012)
  • Author(s): Shoji, K., Ohashi, K., Sampei, K., Oikawa, M., and Mizuno, K.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Volume: 424 Pages: 52-57
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.06.063.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Furry protein promotes Aurora A-mediated Polo-like kinase 1 activation. (2012)
  • Author(s): Ikeda, M., Chiba, S., Ohashi, K., and Mizuno, K.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 287 Pages: 27670-27681
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.378968.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel PKCalpha-mediated phosphorylation site(s) on cofilin and their potential role in terminating histamine release. (2012)
  • Author(s): Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino, K., Kuramasu, M., Nakamura, T., Yanagita, T., Mizuno, K., Hide, I., Nakata, Y., and Saito, N.
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 23 Pages: 3707-3721
  • DOI: 10.1091/mbc.E12-01-0053
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cancer susceptibility and embryonic lethality in Mob1a/1b double-mutant mice. (2012)
  • Author(s): Nishio, M., Hamada, K., Kawahara, K., Sasaki, M., Noguchi, F., Chiba, S., Mizuno, K., et al.
  • Journal Title: J. Clin. Invest. Volume: 122 Pages: 4505-4518
  • DOI: 10.1172/JCI63735.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Identification of Rho-GEFs involved in mechano-biological responses of vascular endothelial cells. (2013)
  • Author(s): Ohashi K., Abiko H., Kondo H., Fujiwara S., Mashiko K., Sakamoto N., Sato M., and Mizuno K.
  • Organizer: International Symposium on Biomedical Engineering Interface
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2013-03-14 – 2013-03-15
• [Presentation] DblファミリーRho-GEFであるCDEPは乳腺上皮細胞の細胞外マトリックスの硬さ依存的な形質転換に関与する (2012)
  • Author(s): 高橋将太、大橋一正、北谷佳那恵、直塚萌、佐藤圭一、阿部彰子、萱場敦子、梶紀子、水野健作
  • Organizer: 第８５回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2012-12-14 – 2012-12-16
• [Presentation] The Regulation of the Organ Morphology Via Cytoskeletal Remodeoing. (2012)
  • Author(s): Ritsuko Morita, Miho Kihira, Yousuke Nakatsu, Youhei Nomoto, Miho Ogawa, Kazumasa Ohashi, Kensaku Mizuno, Takahashi Tsuji
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2012-12-11 – 2012-12-14
• [Presentation] Identification of Rho-GEFs Involved in Cyclic Stretch-induced Mechanosensing of Vascular Endothelial Cells. (2012)
  • Author(s): Hiroshi Kondo, Kazumasa Ohashi, Hiyori Abiko, Ryuichi Hiatari, Naoya Sakamoto, Masaaki Sato, Kensaku Mizuno
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2012-12-11 – 2012-12-14
• [Presentation] アクチン過渡的複合体形成のダイナミクスと細胞運動 (2012)
  • Author(s): 水野健作
  • Organizer: 第１２回日本蛋白質科学会年会、ワークショップ「過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解」
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2012-06-20 – 2012-06-20
  • Invited
• [Presentation] Identification of Rho-GEFs involved in mechanosensing of vascular endothelial cells. (2012)
  • Author(s): Hiroshi Kondo, Kazumasa Ohashi, Hiyori Abiko, Ryuichi Hiatari, Naoya Sakamoto, Masaaki Sato,Kensaku Mizuno
  • Organizer: 第45回日本発生生物学会・第64回日本細胞生物学会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2012-05-28 – 2012-05-31
• [Remarks] 東北大学 大学院生命科学研究科 情報伝達分子解析分野 水野研究室
  • URL: http://www.biology.tohoku.ac.jp/lab-www/mizuno_lab/