2013 Fiscal Year Annual Research Report
単一細胞内での複数のセカンドメッセンジャー動態リアルタイム計測
Publicly Offered Research
| Project Area | Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states. |
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| Project/Area Number |
24121717
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森井 孝 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (90222348)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | ﾊﾞｲｵセンター / イノシトールポリリン酸 / 単一細胞 / PHドメイン / リアルタイム計測 |
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| Research Abstract |
(1) 細胞膜でのフォスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）濃度変化を蛍光により計測
細胞内で発現できるPIP3センサーの土台として、イノシトール四リン酸（IP4）との特異的な結合に依存して構造がわずかながら変化することがX線結晶構造解析から明らかになっているGRP1-PHドメインを用いた。PHドメインの構造情報に基づきcpGFP (circularly permuted GFP)のPHドメインへの融合可能な位置及びPIP3もしくはIP4の結合により構造変化する領域を評価し、構造変化の大きなループ部位でPHドメインを分割し（Split PHドメイン）、融合する位置及びリンカー長を変え、cpGFPを挿入した。円順列変異を施した蛍光性タンパク質cpGFPとリセプターとしてSplit化したGRP1-PHドメインを融合させたバイオセンサーは、IP4濃度変化に対して応答することを細胞外で確認した。
(2) 種類の異なるイノシトールポリリン酸濃度変化を単一細胞内で同時計測
カルシウムセンサーとイノシトール三リン酸（IP3）センサー、カルシウムセンサーとIP4センサーを導入したHeLa細胞において、それぞれカルシウム濃度とIP3濃度、カルシウム濃度とIP4濃度のヒスタミン刺激による時間的・空間的濃度変化を単一細胞内で同時にリアルタイムで計測する手法を確立した。IP3キナーゼの阻害剤として知られている小分子を用いて、単一細胞内でアゴニスト刺激に応じたカルシウムイオンとIP3 、IP4の動態を解析したところ、細胞内においてカルシウムイオン濃度が周期的に変動する「オシレーション」の発現にはIP3産生だけでなくIP4産生もまた重要な役割を果たすことが明らかになった。本手法が単一細胞内イノシトールリン酸類濃度変化を制御する小分子のスクリーニングを行ううえでの有用性を実証した。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Genetically encoded fluorescent thermo-sensors for visualizing subcellular thermoregulation in living cells.2013
Author(s)
Kiyonaka, S., Kajimoto, T., Sakaguchi, R., Shinmi, D., Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H., Imamura, H., Yoshizaki, T., Hamachi, I., Morii, T., Mori, Y.
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Journal Title
Nat. Methods
Volume: 10
Pages: 1232-1238
DOI
Peer Reviewed
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