2013 Fiscal Year Annual Research Report
光応答性ナノ材料による脂質二重膜構造変換とその医療応用
Publicly Offered Research
| Project Area | Development of Molecular Robots equipped with sensors and intelligence |
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| Project/Area Number |
25104514
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
村上 達也 京都大学, 物質-細胞統合システム拠点, 准教授 (90410737)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー |
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| Research Abstract |
本申請課題では、リン脂質二重膜で被覆された光熱変換ナノ材料(cell-penetrating high-density lipoprotein (cpHDL)と金ナノロッド(AuNR)の複合体(cpHDL-AuNR))に、細胞毒性の比較的少ない近赤外光を用いて、熱による細胞膜融合という新しい細胞工学的手法を目指している。昨年度は蛍光プレートリーダーとFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いた膜融合評価系、lipid mixing assay、を確立した。本系によると、100 nmリポソームに対してcpHDL単独でもやや膜融合が生じることが示唆された。
2種類の蛍光色素(NBD-PEとRh-PE)を含むcpHDLを作製し、このcpHDLでAuNRを被覆した。A03班の濱田勉博士の研究室にて、giant unilamellar vesicle (GUV)と蛍光ラベルcpHDL-AuNRの光照射による膜融合をFRET解消を指標として評価したが、cpHDL-AuNRのGUVへの接着は観察されたものの、レーザー照射下で明確な膜融合（＝NBD-PE蛍光増強）は観察されなかった。この理由として、濱田研のレーザー波長が1064 nmと金ナノロッドの近赤外ピーク波長(~800 nm)とあまり一致していなかったことが考えられた。そこで720-950 nmで波長可変の近赤外レーザー（現有機器）を用いて、AuNRにより適した波長のレーザーを照射下、蛍光画像撮影とNBD-PE蛍光強度定量を同時に可能にする顕微鏡システムを開発した。光路途中にExpanderを設置することにより、レーザースポット径を1細胞局所（数マイクロメートル）から細胞数個のレベルの間で調節することが可能である。今後この顕微鏡システムを用いて再検討すると共に、膜融合に有利に働くリン脂質を用いてcpHDL-AuNRを作製する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
濱田勉博士との共同研究開始、膜融合活性評価系の立ち上げ、膜融合評価のための蛍光ラベルcpHDL-AuNRの作製、波長可変近赤外レーザー導入蛍光顕微鏡システムの構築など、目標達成に向けた研究環境が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度確立した近赤外レーザー導入蛍光顕微鏡システムを用いて、100 nmリポソームおよびGUVとcpHDL-AuNRの近赤外レーザー照射下でのlipid mixing assay（NBD-PE蛍光強度の時間変化追跡）を行う。一般に、曲率のより高い100 nmリポソームの方が、GUVよりも膜融合への感受性が高いとされている。さらにcpHDL単独と100 nmリポソームとの膜融合の効率がかなり低いことがわかったため、cpHDL作製条件を最適化する。具体的にはcpHDLの脂質を膜融合に有利に働くとされるフォスファチジルエタノールアミンやジアシルグリセロールなどに変更し、cpHDLのタンパク質のカチオン性を増強する（オリゴアルギニンの利用）。まずは100 nmリポソームを用い、その後GUVを用いて評価する。GUVとの膜融合活性が観察されれば、生細胞を用いて同様の実験を行う。さらに齊藤博英博士よりご提供頂いたsiRNA誘導体とcpHDL-AuNRを組み合わせ、RNAi効果の光制御の可能性を追求する。
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Research Products
(14 results)
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[Journal Article] Helicity-selective photoreaction of single-walled carbon nanotubes with organosulfur compounds in the presence of oxygen2013
Author(s)
Maeda, Y.; Higo, J.; Amagai, Y.; Matsui, J.; Ohkubo, K.; Yoshigoe, Y.; Hashimoto, M.; Eguchi, K.; Yamada, M.; Hasegawa, T.; Sato, Y.; Zhou, J.; Lu, J.; Miyashita, T.; Fukuzumi, S.; Murakami, T.; Tohji, K.; Nagase, S.; Akasaka, S.
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Journal Title
J. Am. Chem. Soc.
Volume: 135
Pages: 6356-6362
DOI
Peer Reviewed
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