ユニークな骨格を持つ放線菌由来二次代謝産物の生合成経路の解明

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification
• Project/Area Number: 25108706
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 勝山 陽平 東京大学, 農学生命科学研究科, 講師 (50646437)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 生合成 / 天然物 / ポリケタイド / 非リボソームペプチド

Research Abstract

化合物１生合成遺伝子を持つBACをS. albusに形質転換した結果、S. albusが化合物１を生産する事を確認した。また、培地条件を検討し、ISP2培地において組換えS. albusが十分量の化合物２を生産する事を見出した。また、最小培地においては生産量が減少する事が明らかとなった。
化合物２生産株である、JE-08の効率的な破壊系の構築に成功した。これにより、化合物２の生合成を担うと予想される遺伝子破壊株の取得を可能にした。その結果、いくつかの遺伝子破壊株で中間体と思われる化合物の蓄積が見られた。これらの化合物の単離同定を試みたが、化合物が不安定であったため、単離同定出来なかった。そこで、それらの化合物の分子量から構造を推定し、全体の生合成経路を推定した。化合物２の生合成に特に重要と考えられる酵素を二つ選定し、大腸菌で異種発現させた結果、可溶性タンパク質を得る事が出来た。
化合物３の生合成遺伝子のうち、特に重要なα-メチルセリン合成酵素、非リボソーム依存ペプチド合成酵素のin vitro解析を行った。前者に関しては組換えタンパク質の解析を行い、α-メチルセリンの合成を担っている可能性を示唆した。また、非リボソーム依存ペプチド合成酵素の基質特異性を解析する事で生合成経路全体を予想する事に成功した。また、ペプチド合成に必要な非リボソーム依存ペプチド合成酵素全てと基質を試験管内で反応させた結果、反応が進行し、化合物３のアナログが得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

化合物１の解析においては、生合成遺伝子に変異を入れる作業がやや難航しているため、実験の進行が当初の計画よりも遅れている。
化合物２では当初の計画通り、JE-08株の遺伝子組換え系の構築に成功し、全ての生合成遺伝子の破壊株の作製に成功した。中間体の構造決定にはいたらなかったが、生合成経路の予測には成功した。また、試験管内での解析用のタンパク質の発現に成功している。
化合物３では生合成に重要な酵素の解析を行う事に成功した。また、この実験では当初困難だと考えていた、非リボソーム依存ペプチド合成酵素の全長タンパク質の活性型での発現に成功した。
一部、遅れが出ているが、一部の実験で予想を上回る結果が得られたため、おおむね順調に進んでいるとした。

Strategy for Future Research Activity

化合物１の研究に関しては、まず、遺伝子破壊株の構築を優先する。破壊株の構築が難航している原因はBACの正確な配列を把握していないためであると考えられるので、配列の同定を行う。
化合物２に関しては生合成中間体の同定をまず行う。化合物が不安定なため、全ての化合物の構造決定は難しいが、一部の安定な中間体の単離構造決定を行う。また、５員環の形成が生合成経路において最も興味深い反応であると考えられるので、その反応の試験管内での再構成を行う。その後、ホモロジーモデリングを通して部位特異的変異導入を試みる。
化合物３に関しては、試験管内で全反応の再構成に成功したため、その反応系を用いて、酵素の反応機構のより詳細な解析を行う。酵素の部位特異的変異導入を行い、酵素活性に重要なアミノ酸を同定する。また、予定通り、異種発現を用いた類縁体の生産を試みる。

Research Products

• [Presentation] Biosynthesis of JBIR-34,35, nonribosomal peptides containing unusual methyloxazoline group (2013)
  • Author(s): Yohei Katsuyama, Adeline Muliandi, Miho Izumikawa, Tomohiro Moriya, Ikuko Kozone, Junko Hashimoto, Motoki Takagi, Kazuo Shin-ya, Yasuo Ohnishi
  • Organizer: 1st European Conference on Natural Products
  • Place of Presentation: DECHEMA-HAUS, FRANKFURT AM MAIN
  • Year and Date: 20130922-20130925
• [Presentation] 非リボソームペプチドJBIR-34, JBIR-35の生合成 (2013)
  • Author(s): 勝山 陽平, アデリン ムリアンディ, 曽根 薫, 泉川 美穂, 守屋 智博, 小曽根 郁子, 橋本 絢子, 高木 基樹, 新家 一男, 大西 康夫
  • Organizer: 放線菌学会
  • Place of Presentation: メルパルク広島
  • Year and Date: 20130905-20130906