2013 Fiscal Year Annual Research Report
放線菌由来特異二次代謝生合成マシナリーの解析および人為制御による有用分子生産
Publicly Offered Research
| Project Area | Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification |
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| Project/Area Number |
25108718
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
荒川 賢治 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (80346527)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ポリケチド / 生合成 / 放線菌 / シグナル分子 / ピロロキノリンキノン / アゾキシアルケン |
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| Research Abstract |
本年度は以下の項目について解析した；（１）LC生合成におけるモジュラー・反復混合型PKSの解析，（２）二次代謝誘導シグナル分子SRBの生合成機構解析，（３）分子多様性を創出する二次代謝生合成酵素の機能解析，（４）人為制御による潜在的二次代謝産物の活性化および生合成マシナリーの解析。
（１）LCポリケチド生合成におけるモジュール・反復型ポリケチド生合成に関して、LkcF-KR1ドメインの還元立体性を司るアミノ酸残基の点変異を行った。この変異株はLC非生産となったものの目的の非還元中間体の蓄積は認められなかった。現在は生合成後期の還元反応を司るLkcF-KR2ドメインの点変異株構築を行っている。
（２）S. rocheiのLC,LM生合成を誘導するシグナル分子SRB1,SRB2の生合成に関与するP450遺伝子srrO (orf84)の変異株から6'-デオキソSRBsの蓄積を見いだした。これはSrrOが6'位の酸化反応に関与することを示唆している。本タンパク質を大量発現し、合成により調製した6'-デオキソSRB1との反応に賦したところ、基質変換が認められた。
（３）Orf23を放線菌で発現させたところ、タンパク量は少なかったもののHis-tag融合タンパクとして取得できた。本酵素を用いて基質の変換反応を行ったところ、ランカサイジノールが効率よくランカサイジンＣへと変換されることを見いだした。
（４）制御遺伝子などの多重遺伝子変異株から、通常培養で生産しないアゾキシアルケン型化合物の蓄積を見いだした。本化合物の生合成遺伝子クラスターはA03班との共同研究により推定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績で記載した（１）であるが、LkcF-KR1ドメインの還元立体性を司るアミノ酸残基の点変異は立体選択性の改変にはつながらず、酵素活性の低下にとどまる結果であった。
（２）に関しては、SrrOのSRB生合成への関与を示唆する結果が得られた。（３）に関してもOrf23がランカサイジノール→ランカサイジンＣへの関与を見いだすことが出来、多様な生合成酵素の機能解析の一歩を踏み出すことが出来たと考えている。しかし、現状ではいずれの場合もタンパク量が少なく、純粋かつ十分量なタンパクが得られていない。これらの成果を報文化するに当たり、タンパク取得の効率向上が肝要であり、平成２６年度に最適培養・精製条件の確立も目指す。
（４）に関しては、新規化合物ではなかったものの潜在的二次代謝クラスターの覚醒という視点では興味深い成果を得られたと考えている。とくに本化合物の生合成起源・生合成遺伝子クラスターはともに不明であるので、本研究を推進して行く所存である。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画最終年度に当たる平成２６年度は、上述の解析をさらに進めるとともに、人為制御による潜在的二次代謝産物の活性化および生合成マシナリーの解析、を中心的に取り組む予定である。
（１）に関しては、生合成後期の還元反応を司るLkcF-KR2ドメインの点変異株構築を行い、LCの特異な生合成系を解明したいと考えている。
（２）（３）に関しては、タンパク発現系の再構築に注力し、生合成酵素の生化学的諸性質を明らかにしたいと考えている。
（４）に関しては、本年度の研究で得られたアゾキシアルケン化合物の生合成起源・生合成マシナリーの解析を引き続き行っていく予定である。とくにアゾ結合の生合成に注目し、遺伝子破壊株からの生合成中間体の取得、生合成酵素とのin vitro反応を有機的に組み合わせ、先駆的な成果を導き出すよう研究遂行する所存である。
本研究と独立して、本菌の染色体塩基配列のアセンブルおよびORF解析を進めているが、100 kb以上のcontigが30本（最長Contig長; 392kb）得られ、他のcontigとあわせたカバー長は8.18Mbであった。また制御遺伝子の多重変異株において、複数の二次代謝遺伝子の覚醒にも成功し、さらに本菌における線状プラスミドが線状染色体の線状構造を維持するのに必要不可欠であることを見いだすことが出来た。これらの発見は本菌の全ゲノム解析および潜在的二次代謝クラスターの覚醒を行う上で強力なモチベーションとなっており、多面的視野から特異二次代謝生合成マシナリーの解明に貢献していくよう研究推進する所存である。
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Research Products
(17 results)
