2013 Fiscal Year Annual Research Report
環状アミン・ポリケタイド融合化合物の生合成研究と微生物生産
Publicly Offered Research
| Project Area | Biosynthetic machinery: Deciphering and regulating the system for bioactive metabolite diversification |
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| Project/Area Number |
25108721
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
鮒 信学 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (70361574)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 生合成 |
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| Research Abstract |
1. tropane alkaloidの生合成の解明に向けて
ベラドンナAtropa belladonna、コダチチョウセンアサガオDatura arborea、ヒヨスHyoscyamus niger、ハシリドコロ Scopolia japonicaのcDNAライブラリーの作製に取り組んだ。その結果、ベラドンナおよびヒヨスのcDNAライブラリーの作製に成功した。
2. N-methyl-Δ1-pyrroliniumの微生物生産
putrescineを出発物質とし、N-methyl-Δ1-pyrroliniumを生体内で生産する組換え大腸菌の作製を行った。Nicotiana tabacumのPutrescine N-methyltransferase（PMT）とN-methylputrescine oxidase（MPO）のcDNAをDUET vectorを用いて大腸菌で発現した。PMTを発現した大腸菌の培養液をダンシル化しHPLCで分析した結果、ダンシル化Putrescineとダンシル化Methylputrescineが確認された。また、PMTとMPOを共発現させた大腸菌の培養液をダンシル化しHPLCで分析した結果、ダンシル化Methylputrescineの生産量がPMTのみを発現させた場合と比較して減少していた。以上より、PMT、MPO共発現株ではN-methyl-Δ1-pyrroliniumが生産されていると考えられる。
3. III型ポリケタイド合成酵素OKSと共に機能する新規サイクラーゼの探索
西洋オトギリソウのデーターベースから環化酵素の候補を抽出し、それらの組換え蛋白質を大腸菌より調整した。候補蛋白質をOKSとin vitroで反応させたが、現在のところ、10以上の候補のうちエモジンアンスロンを合成する酵素は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. tropane alkaloidの生合成の解明
cDNAライブラリーの構築に成功し、発現ライブラリーを構築できた。当初の予定通りの進行度である。
2. N-methyl-Δ1-pyrroliniumの微生物生産
1.のライブライリーを用いたスクリーニングを行うため、前倒しで研究を開始し、N-methyl-Δ1-pyrroliniumの生産に成功した。
3. III型ポリケタイド合成酵素OKSと共に機能する新規サイクラーゼの探索
データベースからのスクリーニングには成功しなかったが、その場合はcDNAライブラリーからの探索を行う予定であり、既に植物体からのmRNAの抽出に取り組んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. tropane alkaloidの生合成の解明
ベラドンナおよびヒヨスのcDNAライブラリーの作製に成功しており、今後、type III polyketide synthaseをスクリーニングする。berberine bridge enzyme family (BBL)はReticulineを酸化し、Berberine骨格を形成する酵素である。また、Mannich反応を触媒する生合成酵素の報告例はないが、プロリンやリパーゼが不斉Mannich反応を触媒する報告例がある。今後、BBL酵素およびMannich反応を触媒する酵素をcDNAライブラリーからスクリーニングする。
2. N-methyl-Δ1-pyrroliniumの微生物生産
今後、標品N-methyl-Δ1-pyrroliniumを合成し、N-methyl-Δ1-pyrroliniumの直接的な分析系を構築する。
3. III型ポリケタイド合成酵素OKSと共に機能する新規サイクラーゼの探索
西洋オトギリソウからmRNAを調製し、cDNAの発現ライブラリーを構築する。また、III型ポリケタイド合成酵素OKSの微生物発現系を作製する。その際、acetyl-CoA carboxylaseを発現させるなど、基質の供給系も強化し、OKSによるオクタケタイド鎖の生産系を作る。この系に対し、西洋オトギリソウのcDNAの発現ライブラリーを発現し、新規サイクラーゼを探索する。
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[Journal Article] Structural basis for cyclization specificity of two Azotobacter type III polyketide synthases: a single amino acid substitution reverses their cyclization specificity2013
Author(s)
Satou, R., Miyanaga, A., Ozawa, H., Funa, N., Katuyama, Y., Tanokura, M., Ohnishi, Y., and Horinouchi
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Journal Title
Journal of Biological Chemistry
Volume: 288
Pages: 34146-34157
Peer Reviewed
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