2013 Fiscal Year Annual Research Report
繊毛形成に関わるIFT粒子の構造と機能の解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Cilium-centrosome system regulating biosignal flows |
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| Project/Area Number |
25113504
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
豊島 陽子 東京大学, 総合文化研究科, 教授 (40158043)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | テトラヒメナ / 繊毛タンパク質 / 外腕ダイニン / 遺伝子導入 / ダイニン重鎖 / ダイニン軽鎖１ |
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| Research Abstract |
テトラヒメナでの相同組換えによるダイニン重鎖組換え体作成のために、テトラヒメナ用にコドンを最適化したhGFPタグ (GFPのループ内にHisタグを挿入), hsGFP-tag (GFPのループ内にHisタグ, SBPタグを挿入)した蛍光観察・精製・構造解析用の多機能タグを構築した。これらのタグを相同組換えでテトラヒメナ大核内に導入するための薬剤耐性遺伝子とのカセットとなったベクターを構築した。テトラヒメナの大核内には遺伝子が45コピー存在しているため、組換え体遺伝子の割合を増やすため、薬剤濃度を段階的に上げながら培養を続ける工程(フェノティピック・アソートメント)が必要である。そのために、外腕ダイニンβHC(DYH4)にhGFPを付加し、フェノティピック・アソートメントを行ったところ、45コピーの遺伝子が全て組換え体ダイニン重鎖に置き換わった株として樹立することができた。
組換え体ダイニン重鎖が繊毛内に局在することを蛍光顕微鏡観察とウェスタンブロッティングにより確認した。さらに繊毛からの組換え体ダイニン複合体の精製を行ったところ、野生株よりも組換え体テトラヒメナにおいて、ダイニン重鎖の分解が起こりやすいことが判明したため、培養条件・精製条件を改善することで、組換え体ダイニン重鎖の分解が起こらない精製法を確立した。精製された組換え体ダイニンの電子顕微鏡観察を行ったところ、野生型と同様に複合体となっていることが判明し、導入したHisタグに対してNi-NTA金ナノ粒子の標識にも成功した。
また、hsGFPタグを外腕ダイニン軽鎖LC1に付加し、SBP-tagでの外腕ダイニン複合体の精製が可能であることを確認した。LC1についても導入したHisタグに対してNi-NTAナノ金粒子標識を試したところ、ダイニン複合体のストーク上に結合するという結果が得られ、頭部ドメインに結合すると考えられていたこれまでの推定モデルを修正するものとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画で掲げていた、①テトラヒメナにおける繊毛タンパク質組換え体の発現、を達成することができた。②IFT粒子の単離とターゲットタンパク質の位置の同定、についてはダイニン重鎖とダイニン軽鎖の研究が進展したために、時間的に進めることができなかった。
ダイニン重鎖の組換え体作成とその精製に成功したことと、ダイニン軽鎖（LC1)の組換え体においても外腕複合体として精製することができたこと、さらにLC1がダイニンストーク上に存在することを明らかにできたことは、意義が大きい。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度に、テトラヒメナ形質転換体作製・組換え体ダイニン重鎖の精製系が確立できたので、平成26年度は、ダイニン2重鎖についても発現・精製を行い、in vitroでの性質を明らかとする。また、細胞内で協働して働くタンパク質も共精製することを目指す。
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Research Products
(17 results)
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[Journal Article] Formation of ring-shaped microtubule assemblies through active self-organization on dynein.2014
Author(s)
Ito, M., Arif Md. Rashedul Kabir, A.,M.,R. Inoue, D., Torisawa, T, Toyoshima, Y.Y., Sada1, K. & Kakugo, A.
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Journal Title
Polymer J.
Volume: 46
Pages: 220-225
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Sea lily muscle lacks a troponin-regulatory system, while it contains2014
Author(s)
Obinata, T., Amemiya, S., Takai, R., Sato, N., Ichikawa, M. & Toyoshima, Y.Y.
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Journal Title
Zool. Sci.
Volume: 31
Pages: 122-128
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.2013
Author(s)
Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y.Y., Amino, M., Oiwa, K., & Kojima, H.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 110
Pages: 501-506
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Self-regulation of cytoplasmic dynein2013
Author(s)
Ken'ya Furuta, Takayuki Torisawa, Akane Furuta, Muneyoshi Ichikawa, Kei Saito, Kauzuhiro Oiwa, Hiroaki Kojima, Yoko Toyoshima
Organizer
American Society for Cell Biology 2013 Annual Meeting
Place of Presentation
New Orleans, USA
Year and Date
20131214-20131218
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[Presentation] Self-regulation of cytoplasmic dynein2013
Author(s)
Ken’ya Furuta, Takayuyki Torisawa, Akane Furuta, Muneyoshi Ichikawa, Kei Saito, Kazuhiro Oiwa, Hiroaki Kojima, Yoko Toyoshima
Organizer
International Workshop Dynein2013
Place of Presentation
兵庫県、神戸オルビスホール
Year and Date
20131031-20131103
Invited
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