聴・平衡覚器官のイメージング解析～１分子から個体レベルまで～

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Mutli-dimensional fluorescence live imaging of cellular function and molecular activity
• Project/Area Number: 25113715
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 齋藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 内耳 / イメージング / 難聴 / Cdc42 / アクチン

Research Abstract

老人性難聴など原因不明の聴・平衡覚障害に苦しむ人々は、驚くほど多い。にもかかわらず、内耳が微細構造体 (聴・平衡毛や耳石)であることなどから、治療法開発が十分に進んでいない。本研究は、内耳研究を発展させる一手段として、内耳（聴・平衡覚）有毛細胞特異的に種々の分子をノックアウトしたマウスを用い、さらに、イメージング手法を駆使することにより、内耳疾患の新規治療法の開発に繋がるような新しい研究手法を確立しようというものである。
本年度の研究において、Cdc42を内耳有毛細胞特異的にノックアウト（KO）したマウスを用いた研究を重点的に行った。Cdc42 KO聴覚有毛細胞の電子顕微鏡解析では、聴毛（不動毛）の欠落・癒合が認められた。初代蝸牛器官培養内の有毛細胞に発現させたアデノウイルスGFP-Cdc42は、聴毛を覆う形質膜と頂側に近い側壁に局在した。微絨毛（不動毛）を有するMDCK細胞を聴覚有毛細胞のモデル細胞として用いると、1) GFP-Cdc42安定発現細胞株のcyst形成条件下の培養では、GFP-Cdc42はcyst管腔に面する頂側面と頂側に近い側壁に局在し、2) Cdc42-ノックダウン（KD）安定細胞株のインサート膜上培養では、微絨毛の減少や癒合とTight junction (TJ) のマーカーであるZO1の細胞内停留が認められた。Cdc42 FRET biosensor TG miceの聴覚有毛細胞を用いた二光子蛍光顕微鏡観察では、Cdc42は、聴毛膜の先端部で強い、頂側に近い側壁で弱い活性化を示した。Cdc42-KD細胞株における細胞内シグナルに関しては、CofilinとMyosin phosphatase 1 (MYPT1) のリン酸化亢進に代表されるアクチン代謝障害と代償経路の活性化 (RhoA→ROCK→ LIMK2→Cofilin, RhoA→ROCK→MYPT1→MLC) が観察された。
以上より、Cdc42 KOマウスの進行性難聴は、聴覚有毛細胞内の聴毛及びTJでのアクチン代謝障害に起因することを明らかにした。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究計画にあげたほぼすべての研究が順調に進み、満足できる結果が得られた。この結果は論文としてJ. Cell SCi誌に発表した。当初は予定していなかった他のRho family分子の働きについても、細胞接着部位や微絨毛における働きの解析を開始している。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究により、内耳有毛細胞のモデルとしてMDCK細胞の管腔形成を伴う3D培養が有用であることを明らかにした。このモデルを用いて、他のRho familyタンパク質の微絨毛の発生・維持、さらにはtight junctionでの働きを明らかにする。このモデル系を駆使することにより、内耳有毛細胞の生理的な機能を明らかにできるだけではなく、今まで混沌としていたRho familyに属する多くの分子の特異的な機能の解明の糸口となりうる。

Research Products

• [Journal Article] Diacylglycerol kinase gamma regulates antigen-induced mast cell degranulation by mediating Ca2+ influxes (2014)
  • Author(s): Sakuma, M., Shirai, Y., Ueyama, T., and Saito, N.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun, Volume: 445 Pages: 340-345
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.01.197
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Deregulation of the actin cytoskeleton and macropinocytosis in response to phorbol ester by the mutant protein kinase C gamma that causes spinocerebellar ataxia type 14 (2014)
  • Author(s): Yamamoto, K., Seki, T., Yamamoto, H., Adachi, N., Tanaka, S., Hide, I., Saito, N. and Sakai, N.
  • Journal Title: Frontiers in Physiology Volume: 5 Pages: 1-10
  • DOI: 10.3389/fphys.2014.00126
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Diacylglycerol kinase as a possible therapeutic target for neuronal diseases. (2014)
  • Author(s): Shirai, Y and Saito, N
  • Journal Title: Journal of Biomedical Science Volume: 21 Pages: 28-36
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Both the C1 domain and a basic amino acid cluster at C-terminus are important for neurite and branch induction ability of DGK. (2014)
  • Author(s): Takuya Kano, Takeshi Kouzuki, Satoru Mizuno, Shuji Ueda, Minoru Yamanoue, Fumio Sakane, Naoaki Saito and Yasuhito Shirai
  • Journal Title: iochem. Biophys. Res. Commun Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.03.113.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Maintenance of stereocilia and apical junctional complexes by Cdc42 in cochlear hair cells, (2014)
  • Author(s): Ueyama, T., Sakaguchi, H., Nakamura, T., Goto, A., Morioka, S., Shimizu, A., Nakao, K., Hishikawa, Y., Ninoyu, Y., Kassai, H., Suetsug, J., Koji, T., Fritzsch, B., Yonemura, S., Hisa, Y., Matsuda, M., Aiba, A., and Saito, N.
  • Journal Title: J. Cell Science Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Negative charges in the flexible N-terminal domain of Rho GDP-dissociation inhibitors (RhoGDIs) regulate the targeting of the RhoGDI-Rac1 complex to membranes. (2014)
  • Author(s): Ueyama T, Son J, Kobayashi T, Hamada T, Nakamura T, Sakaguchi H, Shirafuji T, Saito N.
  • Journal Title: J Immunol. Volume: 191 Pages: 2560-2569
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1300209.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutant γPKC that causes spinocerebellar ataxia type 14 upregulates Hsp70, which protects cells from the mutant's cytotoxicity. (2013)
  • Author(s): Ogawa, K., Seki, T., Onji, T., Adachi, N., Tanaka, S., Hide, I., Saito, N. and Sakai, N.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun Volume: 440 Pages: 25-30
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.09.013.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PKC-ε pseudosubstrate and catalytic activity are necessary for membrane delivery during IgG-mediated phagocytosis. (2013)
  • Author(s): Wood, TR., Chow, RY., Hanes, CM., Zhang, X., Kashiwagi, K., Shirai, Y., Trebak, M., Loegering, DJ., Saito, N., and Lennartz, MR.
  • Journal Title: J Leukoc Biol Volume: 94 Pages: 109-122
  • DOI: 10.1189/jlb.1212634
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Increased seizure susceptibility in a mouse with diacylglycerol kinase β 2 deficiency. (2013)
  • Author(s): Ishisaka, M., Tsuruma, K., Shimazawa, M., Shirai, Y., Saito, N., and Hara, H.
  • Journal Title: Neuroscience & Medicine. Volume: 4 Pages: 117-122
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein kinase Cη is targeted to lipid droplets. (2013)
  • Author(s): Suzuki, M., Iio, Y., Saito, N., and Fujimoto, T
  • Journal Title: Histchem Cell Biol. Volume: 139 Pages: 505-511
  • DOI: 10.1007/s00418-013-1083-z.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Both C1B domain and pseudosubstrate region are necessary for saturated fatty acidmembrane; distinct role of intramolecular domains for different translocation. (2013)
  • Author(s): Nishimoto, T., Kashiwagi, K., Saito, N., and Shirai, Y.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 432 Pages: 384-388
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.048.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Protein kinase C and its involvement in neurodegenerative disease. (2014)
  • Author(s): Naoaki Saito
  • Organizer: Symposium on Membrane Biology
  • Place of Presentation: Seattle, WA, USA
  • Year and Date: 20140327-20140327
  • Invited
• [Presentation] 内耳有毛細胞特異的Cdc42ノックアウトマウスは聴毛及び頂側細胞間接着時の アクチン代謝障害により緩徐進行性の高度難聴を呈する (2014)
  • Author(s): 中村 高志、上山 健彦、坂口 博史、後藤 明弘、森岡 繁文、米村 重信、 久 郁男、松田 道行、饗庭 篤、齋藤 尚亮
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター、仙台
  • Year and Date: 20140319-20140319
• [Presentation] A protein kinase Cgamma knockout mice as a Parkinsonian model: Involvement of Pak -Interacting Exchange Factorbeta. (2014)
  • Author(s): 齋藤尚亮
  • Organizer: 第87回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター、仙台
  • Year and Date: 20140319-20140319
• [Presentation] Cde-42 is required for maintenance of stereocilia and apical junctional complexes in cochlear hair cells. (2014)
  • Author(s): Ueyama, T. and Saito, N
  • Organizer: Joint Workshop between University Catholic Louvain and Kobe University
  • Place of Presentation: Brussels, Belgium
  • Year and Date: 20140310-20140310
• [Presentation] Both C1 domain and basic amino acid cluster at C-terminus are important for branching and neurite induction of DGKbeta (2013)
  • Author(s): Shirai,Y., Takuya,K., Kouzuki,T., Ueda,S., Yamanoue,M., Sakane,F. and Saito,N
  • Organizer: Neuro 2013
  • Place of Presentation: 京都国際会館、京都
  • Year and Date: 20130621-20130621