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2013 Fiscal Year Annual Research Report

リン酸化制御因子による細胞壁構築ダイナミクスの解明

Publicly Offered Research

Project AreaPlant cell wall as information-processing system
Project/Area Number 25114514
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Research InstitutionTokyo University of Science

Principal Investigator

松永 幸大  東京理科大学, 理工学部, 准教授 (40323448)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords細胞分裂 / キナーゼ / 細胞壁 / 植物
Research Abstract

植物AURは、紡錘体や細胞板に局在するα型と動原体に局在するβ型に分けることができる。α型のシロイヌナズナAURであるAtAUR1/2が細胞質分裂に関与することから、細胞質分裂の最終過程である細胞壁構築を植物のα型AURが制御する可能性が高い。そこで本研究課題は、細胞壁構築におけるAURによるリン酸化情報処理システムを明らかにすることを目的とした。
1. AUR自己リン酸化モノクローナル抗体の作成
構造予測とAURのキナーゼアッセイの結果からα型AURの自己リン酸化部位はAtAUR1:T185、 AtAUR2:T173と予想された。そこでリン酸化修飾ペプチドを中央にして周囲5アミノ酸からなる11残基のペプチドを合成した。抗体の特異性評価のために、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの二つを作製した。HPLC精製後、マウスに免疫しハイブリドーマを得た。ハイブリドーマ上清から、分子間相互作用検出装置Biacoreにより計測したKd値を基に、非リン酸化ペプチドには結合せず、リン酸化ペプチドに結合するもっとも特異性の高い抗体を選抜した。リガンドチオールカップリングでセンサーチップにペプチドを固定し、ハイブリドーマ上清を流路に流し、結合と解離をBiacore解析した。
2. AURのリン酸化プロテオーム解析とキナーゼアッセイ
AUR変異体の細胞抽出液を用いて、フーリエ変換リニアイオントラップによるハイブリッド質量分析計LTQ Orbitrap XLで分析しリン酸化ペプチドを同定した。放射性同位元素32Pを使用せず、ATPγSにより形成されるチオリン酸エステルを抗体で検出するNon-RIキナーゼアッセイにより、リン酸化修飾されるセリン/スレオニン残基を特定した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

AURのリン酸化プロテオーム解析とキナーゼアッセイ解析により多数の基質が同定された上に、転写因子のアルファスクリーニング解析によっても多数の基質が同定された。その中の因子はリン酸化アッセイにより実際に基質となっていることを確認した上に、具体的にリン酸化されるアミノ酸部位まで同定できた。これは細胞壁構築メカニズムを知る上で、当初の計画以上に進展している研究成果と言える。

Strategy for Future Research Activity

前年度、同定した基質と相互作用因子を蛍光タンパク質に連結してイメージングラインを作製する。このラインをライブイメージングで解析すると共に、タンパク質動態をFRAP解析する。FRAP解析にはAURリン酸化部位をアラニンに置換した非リン酸化変異体や、アスパラギン酸に置換したリン酸化ミミック変異体も作成し解析する。さらに、新学術領域の計画班と連携を続け、細胞壁構築におけるオーロラキナーゼのリン酸化ネットワークの解明を目指す。

  • Research Products

    (10 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (3 results) (of which Invited: 1 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Chromophore-assisted laser inactivation towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.2014

    • Author(s)
      Sano, Y., Watanabe, W. and Matsunaga, S.
    • Journal Title

      JOURNAL OF CELL SCIENCE

      Volume: 127 Pages: 1621-1629

    • DOI

      10.1242/jcs.144527

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The boundary of the meristematic and elongation zones in roots: endoreduplication precedes rapid cell expansion2013

    • Author(s)
      Kohma Hayashi, Junko Hasegawa, Sachihiro Matsunaga
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 3 Pages: 2723

    • DOI

      10.1038/srep02723

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cytokinins control endocycle onset by promoting the expression of an APC/C activator in Arabidopsis roots.2013

    • Author(s)
      Takahashi, N., Kajihara, T., Okamura, C., Kim, Y., Katagiri, Y., Okushima, Y., Matsunaga, S., Hwang, I., and Umeda, M.
    • Journal Title

      CURRENT BIOLOGY

      Volume: 23 Pages: 1812-1817

    • DOI

      10.1016/j.cub.2013.07.051

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] New insights into the dynamics of plant cell nuclei and chromosomes.2013

    • Author(s)
      Matsunaga, S., Katagiri, Y., Nagashima, Y., Sugiyama, T., Hasegawa, J., Hayashi, K. and Sakamoto, T.
    • Journal Title

      INTERNATIONAL REVIEW OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY

      Volume: 305 Pages: 253 - 301

    • DOI

      10.1016/B978-0-12-407695-2.00006-8.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The kinesin-like protein TOP promotes Aurora localisation and induces mitochondrial, chloroplast and nuclear division.2013

    • Author(s)
      Yoshida, Y., Fujiwara, T., Imoto, Y., Yoshida, M., Ohnuma, M., Hirooka, S., Misumi, O., Kuroiwa, H. Kato, S., Matsunaga, S. and Kuroiwa, T.
    • Journal Title

      JOURNAL OF CELL SCIENCE

      Volume: 126 Pages: 2392-2400

    • DOI

      10.1242/jcs.116798.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 植物の動原体局在型オーロラキナーゼは微小管プラス末端制御タンパク質EB1をリン酸化する2013

    • Author(s)
      松永幸大、北原英里奈、栗原大輔、小牧伸一郎、高木麻衣、佐野行己、長島慶宜、中神弘史、伊藤正樹、杉本慶子、橋本隆、松永朋子、坂本卓也
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] Imaging analyses of DNA replication and cell division in root development

    • Author(s)
      Sachihiro Matsunaga
    • Organizer
      第55回日本植物生理学会年会
    • Place of Presentation
      富山大学 五福キャンパス
  • [Presentation] Subnuclear dynamics and cell dynamics in root morphogenesis.

    • Author(s)
      Sachihiro Matsunaga
    • Organizer
      Workshop on Modeling Biomolecular Systems in Cellular Environment
    • Place of Presentation
      京都大学理学研究科セミナーハウス
    • Invited
  • [Book] Atlas of Plant Cell Structure2014

    • Author(s)
      Noguchi, T., Kawano, S., Sakai, A.. Hayashi, Y., Karahara, I., Matsunaga, S., Tsukaya, H.
    • Total Pages
      未定
    • Publisher
      Springer
  • [Remarks] 研究者情報ベースRIDAI

    • URL

      https://www.tus.ac.jp/fac_grad/p/achievement.php?64d9

URL: 

Published: 2015-05-28  

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