2013 Fiscal Year Annual Research Report
リン酸化制御因子による細胞壁構築ダイナミクスの解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Plant cell wall as information-processing system |
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| Project/Area Number |
25114514
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
松永 幸大 東京理科大学, 理工学部, 准教授 (40323448)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 細胞分裂 / キナーゼ / 細胞壁 / 植物 |
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| Research Abstract |
植物AURは、紡錘体や細胞板に局在するα型と動原体に局在するβ型に分けることができる。α型のシロイヌナズナAURであるAtAUR1/2が細胞質分裂に関与することから、細胞質分裂の最終過程である細胞壁構築を植物のα型AURが制御する可能性が高い。そこで本研究課題は、細胞壁構築におけるAURによるリン酸化情報処理システムを明らかにすることを目的とした。
1. AUR自己リン酸化モノクローナル抗体の作成
構造予測とAURのキナーゼアッセイの結果からα型AURの自己リン酸化部位はAtAUR1：T185、 AtAUR2:T173と予想された。そこでリン酸化修飾ペプチドを中央にして周囲5アミノ酸からなる11残基のペプチドを合成した。抗体の特異性評価のために、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの二つを作製した。HPLC精製後、マウスに免疫しハイブリドーマを得た。ハイブリドーマ上清から、分子間相互作用検出装置Biacoreにより計測したKd値を基に、非リン酸化ペプチドには結合せず、リン酸化ペプチドに結合するもっとも特異性の高い抗体を選抜した。リガンドチオールカップリングでセンサーチップにペプチドを固定し、ハイブリドーマ上清を流路に流し、結合と解離をBiacore解析した。
2. AURのリン酸化プロテオーム解析とキナーゼアッセイ
AUR変異体の細胞抽出液を用いて、フーリエ変換リニアイオントラップによるハイブリッド質量分析計LTQ Orbitrap XLで分析しリン酸化ペプチドを同定した。放射性同位元素32Pを使用せず、ATPγSにより形成されるチオリン酸エステルを抗体で検出するNon-RIキナーゼアッセイにより、リン酸化修飾されるセリン/スレオニン残基を特定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
AURのリン酸化プロテオーム解析とキナーゼアッセイ解析により多数の基質が同定された上に、転写因子のアルファスクリーニング解析によっても多数の基質が同定された。その中の因子はリン酸化アッセイにより実際に基質となっていることを確認した上に、具体的にリン酸化されるアミノ酸部位まで同定できた。これは細胞壁構築メカニズムを知る上で、当初の計画以上に進展している研究成果と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度、同定した基質と相互作用因子を蛍光タンパク質に連結してイメージングラインを作製する。このラインをライブイメージングで解析すると共に、タンパク質動態をFRAP解析する。FRAP解析にはAURリン酸化部位をアラニンに置換した非リン酸化変異体や、アスパラギン酸に置換したリン酸化ミミック変異体も作成し解析する。さらに、新学術領域の計画班と連携を続け、細胞壁構築におけるオーロラキナーゼのリン酸化ネットワークの解明を目指す。
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[Journal Article] Cytokinins control endocycle onset by promoting the expression of an APC/C activator in Arabidopsis roots.2013
Author(s)
Takahashi, N., Kajihara, T., Okamura, C., Kim, Y., Katagiri, Y., Okushima, Y., Matsunaga, S., Hwang, I., and Umeda, M.
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Journal Title
CURRENT BIOLOGY
Volume: 23
Pages: 1812-1817
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] New insights into the dynamics of plant cell nuclei and chromosomes.2013
Author(s)
Matsunaga, S., Katagiri, Y., Nagashima, Y., Sugiyama, T., Hasegawa, J., Hayashi, K. and Sakamoto, T.
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Journal Title
INTERNATIONAL REVIEW OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY
Volume: 305
Pages: 253 - 301
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The kinesin-like protein TOP promotes Aurora localisation and induces mitochondrial, chloroplast and nuclear division.2013
Author(s)
Yoshida, Y., Fujiwara, T., Imoto, Y., Yoshida, M., Ohnuma, M., Hirooka, S., Misumi, O., Kuroiwa, H. Kato, S., Matsunaga, S. and Kuroiwa, T.
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Journal Title
JOURNAL OF CELL SCIENCE
Volume: 126
Pages: 2392-2400
DOI
Peer Reviewed
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[Book] Atlas of Plant Cell Structure2014
Author(s)
Noguchi, T., Kawano, S., Sakai, A.. Hayashi, Y., Karahara, I., Matsunaga, S., Tsukaya, H.
Total Pages
未定
Publisher
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
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