2013 Fiscal Year Annual Research Report

新規質量イメージングを用いたＮーアセチルグルコサミン修飾タンパク質の時空間的解析

Publicly Offered Research

Project Area	Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation
Project/Area Number	25117710
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	山本一夫東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (20174782)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords	糖鎖修飾 / 翻訳後修飾 / N-アセチルグルコサミン
Research Abstract	本年度は、N-アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするcDNAをさまざま作成し、HEK293細胞内に発現させて、核内タンパク質及び細胞質タンパク質に見出されるN-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾を更に伸長させることを行った。この伸長した糖鎖は細胞内に存在する加水分解酵素によって分解されることがないため、微量なO-GlcNAc修飾タンパク質をより安定に検出ができること、また通常の細胞では合成されることのない稀少な糖鎖であることから、この2糖を特異的に認識するレクチンプローブを探索した。cell surface display法を用いた改変レクチンのスクリーニングも行ったが、ナツフジから厳密な特異性を持つレクチンを運良く見出し、かつこれらのレクチンを大量に精製することができた。N-アセチルガラクトサミン転移酵素を過剰発現させたHEK293細胞のcell lysateを用いて二次元電気泳動を行った後、このレクチンプローブを用いて、糖転移酵素の有無により特異的に染色されるスポットを検索した。その結果、二次元電気泳動上で90種類ほど見出し、これらに相当するスポットをゲルをから切り出し、MALDI-TOF MSを用いた質量分析によりタンパク質の同定を試みた。その結果、これらのスポットの中から6種類の細胞質内のタンパク質と7種類の核内タンパク質を特定することができた。また、これらのタンパク質をコードする遺伝子の単離も合わせて行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 植物フジの種子からN-アセチルガラクトサミンに厳密な特異的を持つレクチンを運良く発見したことから、レクチンアフィニティクロマトグラフィーを行うためのレクチンを容易に大量精製することができたことは大いに時間の節約になった。また、このレクチンを用いた検出法に関してもさまざまな試行錯誤を行うことができたため、着実な成果を出すことができたと考えている。
Strategy for Future Research Activity	タンパク質上のO-GlcNAc修飾部位を明らかにすることを通して、これらの修飾を受けない変異体を作成し細胞内に発現させることなどを試みる。細胞活性化に伴うO-GlcNAc修飾の有無による細胞応答の変化などを追跡すると共に、他のグループの標的タンパク質に関するO-GlcNAc修飾分析などを通して、積極的に共同研究を進める予定である。また細胞内のO-GlcNAc修飾タンパク質の挙動を追跡するために、これらのGlcNAc修飾タンパク質の追跡を、抗体やレクチンを用いた染色、更には細胞内にレクチンを発現させることにより、動的な細胞内イメージング解析も試みる計画である。