2013 Fiscal Year Annual Research Report
無細胞蛋白質アレイによるポリユビキチン鎖依存シグナル伝達経路の網羅的同定と解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation |
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| Project/Area Number |
25117719
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ユビキチン / 無脂肪タンパク質合成 / ポリユビキチン鎖 / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / シグナル伝達 |
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| Research Abstract |
I．種々のポリユビキチン鎖への相互作用検出技術の確立
予備実験的には成功していたポリユビキチン鎖に結合するタンパク質を高感度に検出できる技術の最適化を行った。その結合検出方法には、アルファスクリーン法を利用した。その原理は、384穴プレート中で、Flagタグでラベルされたユビキチン鎖（モノUb、ダイUb-Ub、テトラUb-Ub-Ubのいずれか）とビオチン化プロテインアレイタンパク質を反応させて、その後ドナービーズとアクセプタービーズを加えて反応させる。もし、ポリユビキチン鎖との相互作用反応が起これば、抗Flag抗体を介して双方のビーズが近接する。このような状態でドナービーズを励起すると、このエネルギーが近接したアクセプタービーズと反応し蛍光を発する。しかし、相互作用が起こらなければ、双方のビーズが近接できず、蛍光を発することができない。本手法を用いて、既知に報告されているA20タンパク質のZF7ドメインと直鎖状型ポリユビキチン鎖との結合を検出することができた。この事は、高感度にポリユビキチン鎖への相互作用反応が検出できる技術が確立できたことを意味する。
II．アルファスクリーン法によるK63および直鎖状ポリユビキチン鎖と相互作用するシグナル伝達関連蛋白質の同定
我々の研究室で進めきた手法を用いて、Ｎ末端にビオチン化した各種組換えプロテインアレイを構築することができた。最終的には、約400種のプロテインキナーゼ、250種のE3リガーゼおよび50種類の相互作用タンパク質からなるプロテインアレイを作成することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画どおりに、ポリユビキチン鎖と結合するタンパク質のハイスループットな検出技術の確立、およびプロテインアレイの構築に成功しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本技術を用いて、ポリユビキチン鎖に結合するタンパク質の網羅的な解析を行う。
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[Journal Article] Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels.2013
Author(s)
Ishigami T, Abe K, Aoki I, Minegishi S, Ryo A, Matsunaga S, Matsuoka K, Takeda H, Sawasaki T, Umemura S, Endo Y.
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Journal Title
FASEB J.
Volume: 27
Pages: 3437-3445
DOI
Peer Reviewed
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