2014 Fiscal Year Annual Research Report
チューブリンチロシンリガーゼとチューブリン複合体の構造解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Regulation of signal transduction by post-translational modifications and its pathogenic dysregulation |
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| Project/Area Number |
25117723
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
三島 正規 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 微小管 / NMR / Ｘ線結晶構造解析 / ＴＴＬ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小管の化学修飾が種々の重要な生命現象に関与していることが近年明らかになってきている。そこでtubulin tyrosine ligase( TTL)の立体構造解析を行い、チューブリンのチロシン化のメカニズムをその立体構造に基づいて理解し、化学修飾による微小管動態制御の構造的基礎を得ることを目的に研究を行った。本研究において全長ヒトTTL1の大腸菌による発現系を構築し、精製系を確立した。大量に封入体を形成したことから、シャペロンの共発現系を用いた。これにより最終的な収量を約５倍にすることに成功した。13C,15N,2Hラベルした蛋白質を調製し、多次元NMR測定に取り組んだ。当初、NMR測定温度でTTL1が凝集を起こし、NMRスペクトルも極めて分離の悪いものであったが、buffer条件の検討を行い、現在までに測定温度で凝集が起こらず、NMR信号の分離のよい条件を見つけることができた。並行して、緑色蛍光タンパク質GFPとTTL1を 融合させることで、コロニーレベルでTTL1の安定を検討するシステムの開発にとりくんだ。ゼノパスのTTLの結晶構造をもとにゼノパスとヒトでの配列を比較することで、ヒトTTL1の変異体を作成したところ、安定性が劇的に向上した。この変異体についても13C,15N,2Hラベルした蛋白質を調製し、多次元NMR測定に取り組んだ。またアルファチューブリンのC末端領域の発現系を構築、標識試料を調製し、NMRチューブ内でチロシン化反応を行い、リアルタイムでのTTLの活性をモニターする系を確立した。またヒトTTL1のＸ線結晶構造解析のため、変異体を用いて結晶化を行った。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Efficient and cost effective production of active-form human PKB using silkworm larvae.2014
Author(s)
Maesaki R, Satoh R, Taoka M, Kanaba T, Asano T, Fujita C, Fujiwara T, Ito Y,Isobe T, Hakoshima T, Maenaka K, Mishima M.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 4
Pages: 6016
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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