2013 Fiscal Year Annual Research Report
AEP複合体による転写サイクルの制御メカニズム
Publicly Offered Research
| Project Area | Integral understanding of the mechanism of transcription cycle through quantitative, high-resolution approaches |
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| Project/Area Number |
25118511
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
横山 明彦 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10506710)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 癌 / 発現制御 / 生体分子 / 内科 / 蛋白質 |
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| Research Abstract |
本研究は我々が以前に分離同定したAEP複合体が様々な転写の様々な局面でどのような働きをしているのかを調べる。AEPはSuper Elongation Complexとも呼ばれ、主に転写の伸長に関わっていると考えられているがその実体は良く分っていない。我々はAEPが転写サイクルの中で果たしている役割を調べるために(1)AEPのゲノムワイドな局在をChIP-seqにて同定する、(2)AEPの各機能ドメインの機能をin vitro転写反応にて調べる、(3)AEPがクロマチン上で形成する複合体を同定する、の三つの課題に取り組んでいる。(1)についてはChIP-seqに使用可能な抗体を探索するために、まず標的クロマチンが明らかになっているMLL fusion発現細胞にてChIP-seqを試みている。MLL fusionはAEPをリクルートすることで転写を活性化するので、この実験でMLL fusionとAEP構成因子が共局在している事が分かれば、その抗体は機能しているという事を意味する。本報告書を作成している時点で、いくつかの抗体が機能している事を示す予備的実験結果を得ていおり、そのうちの一つの抗体についてすでにDeep sequencingを依頼した。ChIP-seqに使用可能な抗体が得られたのであれば、同様の解析をMLL fusionが発現していない細胞(U937)にて調べる予定である。(2)についてはいくつかのGAL4-AEP融合蛋白質の大腸菌での発現系を構築しようとしたが、残念ながら安定に発現する事が難しい事が判明した。(3)については、まずAEP構成因子の一つであるENLの複合体を精製したところ、いくつかの新しい結合因子が同定されて来た。それらの因子はAEPが標的クロマチンを認識する上で重要な役割を果たしていると考えられるので、今後詳細に解析を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に目標としていたAEPのゲノム上の局在の解析はまだ、完了しておらず、2年目にずれ込むことになった。しかし、この解析に使えそうな抗体は目星が立っており、比較的順調に進展しているといえる。一方で二年目に計画していたIn vitro転写系の構築については、前倒しして始めたが、目的のタンパク質が発現し難い性質である事が判明し、めどが立っていない。また、同様に2年目に行うつもりであったENLがクロマチン上で結合しているタンパク質の同定についても前倒しして始めたところ、これまでに多くの新規結合因子が見つかった。まとめると、三つの提案のうち、一つは頓挫しているが、二つは順調に進展しており、概ね進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はChIP-seq解析によるAEPのゲノム上での局在分布の解明とENLの結合因子の機能解析について精力的に研究を進める。In vitro転写系の構築は困難であるため、かわりに細胞内での転写活性化能を調べるレポーターアッセイを応用して、それぞれのAEPドメインが転写に果たしている役割を調べていく。ChIP-seqについてはサンプル調製法の最適化による実験系の改良が進んでいるので、良い結果が得られると期待される。新規ENL結合因子の解析はこれまでに確立した手法で解析するため、問題なく遂行できると思われる。
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