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2013 Fiscal Year Annual Research Report

挿入的クロマチン免疫沈降法(iChIP)による細胞分化制御因子の転写機構の解明

Publicly Offered Research

Project AreaIntegral understanding of the mechanism of transcription cycle through quantitative, high-resolution approaches
Project/Area Number 25118512
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

藤井 穂高  大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (30302665)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords転写 / 分子生物学 / ゲノム生化学 / エピジェネティクス / クロマチン
Research Abstract

1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明
1-1. Pax5遺伝子TSS近傍結合ゲノム領域の同定:iChIP解析用に作製した細胞株3xFNLDD:LexA-Pax5(B)に転写因子C/EBPβを発現させて、マクロファージ様にtrans-differentiateさせた細胞株3xFNLDD:LexA-Pax5 (M)を樹立した。この二つの細胞系を用い、iChIP-Seq法を用いて、B細胞特異的にPax5遺伝子TSS近傍結合ゲノムDNAを網羅的に同定した。
1-2. Pax5遺伝子TSS近傍結合蛋白質の同定とその機能解析:上記二つの細胞を用いて、iChIP-SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) 法により、B細胞特異的なPax5遺伝子TSS近傍結合蛋白質を同定した。さらに、siRNAを用いたLoss-of-function実験によって、上記、1-3で同定された蛋白質がPax5遺伝子転写調節に果たす役割を明らかにした。加えて、この蛋白質に結合する蛋白質を同定し、この蛋白質が関与するPax5遺伝子転写調節の分子機構を解明した。
2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明
2-1. Foxp3遺伝子TSS近傍結合ゲノム領域の同定:iChIP解析用に作製したマウスからT-regとナイーブCD4細胞を単離し、iChIP-Seq法を用いて、T-reg特異的Foxp3遺伝子TSS近傍結合ゲノムDNAを網羅的に同定している。現在、ゲノム支援の枠組みを通じて解析を行っている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明
Pax5プロモーター領域にB細胞特異的に結合しているゲノムDNA・RNA・蛋白質の同定のステップの全てを修了している。結合蛋白質の機能解析については、それに結合する蛋白質の同定と、その機能欠失実験も終えており、現在、論文を投稿中である。結合ゲノム領域については、別の染色体に存在するPax5発現調節領域と思われる領域を同定しており、現在、CRISPR系を用いたこの領域の欠失実験を行っている。
2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明
iChIP解析用マウスから単離したT-regとナイーブCD4T細胞を用いた、iChIP-Seq解析を先行させ、現在使用している3xFNLDD-Tgマウスの系がうまく動作しているか否かを検討している。動作確認が取れれば、iChIP-RNA-Seq解析及びiChIP-MS解析を用いて、Foxp3プロモーター領域結合RNA及び蛋白質の同定へと進む。iChIP-Seq解析の結果から、T-regにおけるiChIP系が動いていないことが示唆された場合、別の3xFNLDD-Tgマウスを用いることにより改善を目指す。

Strategy for Future Research Activity

1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明
Pax5プロモーター結合ゲノム領域については、別の染色体に存在するPax5発現調節領域のCRISPR系を用いた欠失実験の結果、この領域がPax5の発現に必須であることが示された場合、iChIP-Seq解析の結果から、このゲノム領域をいくつかの亜領域に分けて、その亜領域毎の欠失実験を行って、どの亜領域が重要な働きをしているのかを解明する。Pax5プロモーター結合蛋白質については、DT40細胞で得られた知見が、広く他の種にも当てはまるのか、また、細胞系だけでなく動物個体でのB細胞分化にも当てはまるのか、といった疑問を解明するため、マウスを用いた遺伝子欠損実験を進めている。具体的には、当該遺伝子の機能に重要と思われるエクソンをloxP配列で挟んだFloxedマウスを作製し、これとB細胞やリンパ球全般といった組織特異的Cre発現マウスとを交配させることにより、マウスのB細胞分化における当該遺伝子の役割を解明する。
2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明
iChIP-Seq解析のデータを詳細に解析し、T-reg特異的にFoxp3プロモーター領域と結合しているゲノム領域を網羅的に同定する。結合ゲノム領域を、近傍の遺伝子の性状等を指標として、共通制御下にある遺伝子群や、発現調節領域等に分類する。さらに、相互作用の意義を、CRISPR系を利用した欠失実験によって調べる。加えて、iChIP-RNA-Seq解析及びiChIP-MS解析を用いて、Foxp3プロモーター領域結合RNA及び蛋白質の同定を行う。結合RNA及び蛋白質がFoxp3遺伝子発現に果たす役割を、遺伝子破壊・欠失実験等のloss-of-function実験によって明らかにする。

  • Research Products

    (16 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (9 results) (of which Invited: 2 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results) (of which Overseas: 1 results)

  • [Journal Article] TALやCRISPRを用いたenChIP法による特定ゲノム領域の単離と結合分子の同定2014

    • Author(s)
      藤井 穂高
    • Journal Title

      実験医学別冊 「今すぐ始めるゲノム編集」

      Volume: 2014 Pages: 42-43

  • [Journal Article] Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.2013

    • Author(s)
      Fujita T, Fujii H.
    • Journal Title

      Biochem Biophys Res Commun.

      Volume: 439 Pages: 132-6

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2013.08.013.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP).2013

    • Author(s)
      Fujita T, Asano Y, Ohtsuka J, Takada Y, Saito K, Ohki R, Fujii H.
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 3 Pages: 3171

    • DOI

      10.1038/srep03171.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] iChIP法による特定ゲノム領域の単離と結合分子の同定2013

    • Author(s)
      藤井 穂高
    • Journal Title

      遺伝子医学Mook「エピジェネティクスと病気」(メディカルドゥ社)

      Volume: 25 Pages: 254-259

  • [Journal Article] 挿入的クロマチン免疫沈降法 (iChIP) による特定ゲノム領域結合分子の網羅的同定2013

    • Author(s)
      藤田 敏次、藤井 穂高
    • Journal Title

      実験医学(羊土社)

      Volume: 31 Pages: 2629 - 2636

  • [Presentation] Analysis of chromatin mechanisms by locus-specific chromatin immunoprecipitation technologies2014

    • Author(s)
      Hodaka Fujii, Toshitsugu Fujita
    • Organizer
      Keystone Symposium: Chromatin Mechanisms and Cell Physiology
    • Place of Presentation
      Oberstdorf, Germany
    • Year and Date
      20140323-20140328
  • [Presentation] Identification and characterization of promoter-bound molecules involved in transcriptional regulation of Pax5 by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP)2013

    • Author(s)
      Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii
    • Organizer
      2013 日本免疫学会学術集会
    • Place of Presentation
      千葉
    • Year and Date
      20131211-20131213
  • [Presentation] enChIP: a method for locus-specific biochemical analysis of genome functions2013

    • Author(s)
      Toshitsugu Fujita, Yoshinori Asano, Junko Ohtsuka, Kazunobu Saito, Yoko Takada, Reiko Ohki, Hodaka Fujii
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] 新規テロメア結合タンパク質の同定と機能解析 ~がん化への作用の解明~2013

    • Author(s)
      Takigawa Haruka, Yoshinori Asano, Junko Ohtsuka, Toshitsugu Fujita, Namiki Hideo, Hodaka Fujii, Reiko Ohki
    • Organizer
      第36回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      20131203-20131206
  • [Presentation] Locus-specific biochemical analysis of genome functions by iChIP and enChIP2013

    • Author(s)
      Hodaka Fujii
    • Organizer
      Therapeutics Discovery Symposia Asia - 2013, Small RNAs to Stem Cells & Epigenetic Reprogramming - 2013
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20131125-20131126
    • Invited
  • [Presentation] Identification and characterization of promoter-bound molecules involved in transcriptional regulation by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP)2013

    • Author(s)
      Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii
    • Organizer
      Cold Spring Harbor meeting: Mechanisms of Eukaryotic Transcription
    • Place of Presentation
      Cold Spring Harbor, USA
    • Year and Date
      20130827-20130831
  • [Presentation] Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immnoprecipitation (iChIP)2013

    • Author(s)
      Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii
    • Organizer
      15th International Congress of Immunology
    • Place of Presentation
      Milano, Italy
    • Year and Date
      20130822-20130827
  • [Presentation] Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immnoprecipitation (iChIP)2013

    • Author(s)
      Hodaka Fujii
    • Organizer
      Epigenomics & Metabolomics Symposia-2013: Epigenomics, Sequencing & SNiPs-2013
    • Place of Presentation
      Boston, USA
    • Year and Date
      20130710-20130711
    • Invited
  • [Presentation] Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immnoprecipitation (iChIP)2013

    • Author(s)
      Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究年会
    • Place of Presentation
      奈良
    • Year and Date
      20130530-20130531
  • [Remarks] 藤井研究室ホームページ

    • URL

      http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/index.html

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 内在性DNA配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法2013

    • Inventor(s)
      藤井穂高、藤田敏次
    • Industrial Property Rights Holder
      藤井穂高、藤田敏次
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      PCT/JP2013/74107
    • Filing Date
      2013-09-06
    • Overseas

URL: 

Published: 2015-05-28  

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