2013 Fiscal Year Annual Research Report
バクテリアべん毛蛋白質輸送スイッチの分子基盤
Publicly Offered Research
| Project Area | Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses |
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| Project/Area Number |
25121718
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
南野 徹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20402993)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 細菌 / 電子顕微鏡 / 分子モーター / 生物物理 |
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| Research Abstract |
本研究では、X 線結晶構造解析と極低温電子線トモグラフィー法による構造解析を組み合わせることで、フック完成シグナルに伴う輸送装置の基質認識モード切り替え機構を原子レベルで解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。
1. FlgN/FlgK、FliT/FliDおよびFliS/FliCシャペロン・輸送基質複合体は輸送ゲート構成蛋白質であるFlhAのC末細胞質ドメイン (FlhAc) に結合する。本研究では、Biacoreを用いてFlhAcに対する各シャペロン・輸送基質複合体の結合親和性を測定した結果、FlhACに対するFlgN/FlgK複合体の結合親和性はFliT/FliD複合体に比べて僅かに高く、FliS/FliC複合体に比べては14倍程度高いことが判明した。
2. X線結晶構造解析により、FlhAc(F459A)、FlgNおよびFliPのペリプラズミックドメインの構造を決定できた。
3. FlhA-YFPを作成し、輸送装置に組み込まれているFlhA-YFPの分子数を一分子蛍光イメージング法により計測した結果、9分子のFlhA-YFPが輸送装置に組み込まれていることが示唆された。
4. 極低温電子線トモグラフィー法によりin situでの輸送装置の構造解析を行った結果、FlhAcと考えられる電子密度を同定するとともに、FlhAC9量体モデルをその電子密度にあてはめて原子モデルを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
X線結晶構造解析により、FlgN, FlhAc(F459A)およびFliPのペリプラズミックドメインの構造は決定できた。さらに、in situでの輸送装置の構造解析および一分子蛍光イーメージング法により、FlhAの所在およびストイキオメトリーは決定できた。しかしながら、FlhAを中心としたフック完成シグナリング複合体の結晶は未だ得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
安定なフック完成シグナリング複合体を単離精製し、X線結晶構造解析に取り組む。さらに、FlhAcリング複合体の原子モデルの信憑性を遺伝学的および生化学的手法により評価する。
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