T細胞制御機構の構造生物学的基盤

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Structural basis of cell-signalling complexes mediating signal perception, transduction and responses
• Project/Area Number: 25121727
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 池水 信二 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (60333522)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 構造生物学

Research Abstract

近年,IL-6とTGF-βによりナイーブT細胞からTh17細胞が分化することが発見された．Th17細胞は，IL-23の作用により悪性化し，様々な炎症性自己免疫疾患に関与する．また腫瘍において，患部でIL-23の発現が増加し，炎症部位への細胞傷害性T細胞の浸潤が抑制される．その結果，免疫監視能力が低下して腫瘍細胞が増殖する．IL-23とIL-23Rの結合阻害は，腫瘍の増殖を抑制し，また自己免疫疾患の炎症を抑制する．
IL-23はp19とIL-12のp40サブユニットがジスルフィド結合したヘテロ二量体である．IL-23受容体は，特異的なIL-23RとIL-12と共有されるIL-12Rβ1から構成される．抗IL-23抗体を用いてIL-23と受容体の結合を阻害すると炎症が鎮静化する．上記の理由から，抗炎症薬開発を目的として，IL-23とIL-23受容体の認識機構の解明を思い立った．
IL-23については，既に構造解析済みである．IL-12Rβ1については，GSTタグを付加したコンストラクトを大腸菌で発現させ，精製を行った．現在，GSTタグの切断条件の検討を進めているところである．IL-23Rの細胞外ドメインは，３つのドメイン(D)から構成される．IL-23R D2-D3は，サイトカイン結合ホモロジー領域であり，この領域を発現させた後，IL-23との結合実験を行ったが結合しなかった．そのため，D1を含むタンパク質の発現を，大腸菌，昆虫細胞，動物細胞を用いて試みているが成功に至っていない．現在，D1を含むIL-23Rの発現方の確立を行っているところである．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

IL-23RおよびIL-12Rβ1の発現・精製・結晶化
IL-23Rは免疫グロブリン様ドメイン(D1)と２つのIII型フィブロネクチンドメイン（D2－D3）から構成される．サイトカイン結合領域様ドメインはD2D3であるが，調製したIL-23R D2-D3はIL-23と結合しなかったため，D1単独，およびD1-D3のコンストラクトを作成し発現を試みているが，大腸菌および動物細胞であるHEK293Tでは発現量が低かった．現在，高発現の条件を検索しているところである．
IL-23/IL-12Rβ1複合体結晶の調製および構造解析
IL-12Rβ1をGST融合蛋白質として発現・精製を行っているが，GSTの切除が上手く行かなかった．

Strategy for Future Research Activity

IL-23RおよびIL-12Rβ1の発現・精製・結晶化
IL-23RのD1単独およびD1-D3の発現を大腸菌および動物細胞をであるHEK293Tでを用いて試みているが，膜行かなかった．現在，昆虫細胞を用いて高発現の条件を検索しているところである．
IL-23/IL-12Rβ1複合体結晶の調製および構造解析
IL-12Rβ1はGST融合蛋白質として発現・精製を行っているが，GSTの切除に成功していない．現在，GSTと目的蛋白質の間の酵素部位の改変を行っているところである．

Research Products

• [Journal Article] Mutants of lymphotoxin-<alpha> with augmented cytotoxic activity via TNFR1 for use in cancer therapy. (2013)
  • Author(s): Morishige, T., Narimatsu, S., Ikemizu, S., Tsunooda, S., Tsutsumi Y., Mukai, Y., Okada, N., Nakagawa, S.
  • Journal Title: Cytokine Volume: 61 Pages: 578-584
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of human MTH1 with a homogeneous N-terminus. (2013)
  • Author(s): Koga, Y., Inazato, M., Nakamura, T., Hashikawa, C., Chirifu, M., Michi, A., Yamashita, T., Toma, S., Kuniyasu, A., Ikemizu, S., Nakabeppu, Y., & Yamagata, Y.
  • Journal Title: Acta Crysatllogr. F Volume: 69 Pages: 45-48
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of antibodies against amyloidogenic transthyretin (ATTR) on phenotypes of patients with familial amyloidotic polyneuropathy (FAP) ATTR Valine30Methionine. (2013)
  • Author(s): Obayashi, K., Tasaki, M., Jono, H., Ueda, M., Shinriki, S., Misumi, Y., Yamashita, T., Oshima, T., Nakamura, T., Ikemizu, S., Anan, I., Suhr, O., & Ando, Y.
  • Journal Title: Clin. Chim. Acta Volume: 419 Pages: 127-131
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure and interactions of the human programmed cell death 1 receptor. (2013)
  • Author(s): Cheng, X., Veverka, V., Radhakrishnan, A., Waters, L.C., Muskett, F.W., Morgan, S., Huo, J., Yu, C., Evans, E.J., Leslie, A.J., Griffiths, M., Stubberfield, C., Griffin, R., Henry, A.J., Jansson, A., Ladbury, J.E., Ikemizu, S., Carr, M.D., Davis, S.J.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 288 Pages: 11771-11785
  • Peer Reviewed