2013 Fiscal Year Annual Research Report
位置固有な四肢軟骨成長を制御するHox遺伝子の標的遺伝子の分離同定
Publicly Offered Research
| Project Area | Molecular mechanisms underlying reconstruction of 3D structers during regeneration |
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| Project/Area Number |
25124703
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
黒岩 厚 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (20134611)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 四肢形成 / Hox遺伝子 / 軟骨形成 / ChIP-SEQ / Hox標的遺伝子 |
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| Research Abstract |
(1)自脚軟骨増殖期におけるHox標的遺伝子の同定
抗HoxA-13抗体及び抗HoxD-13抗体を用いたChIPによる、自脚軟骨増殖期におけるHox の標的遺伝子の同定を行うための様々な条件検討を行った。まず、当研究室で調製したウサギポリクローナル抗体を用いて、マウス胚肢芽核抽出タンパク質から再現性よく40%以上のHoxA-13もしくはHoxD-13タンパク質を回収する条件を決定した。既にE11.0マウス胚肢芽Hoxの標的として知られているShhの肢芽エンハンサーの濃縮を指標としてChIP を行い、クロマチン固定、断片化、免疫沈降の条件を決定した。モデル標的の濃縮率は、非特異的配列対照と比較して、抗HoxA-13抗体では2倍、抗HoxD-13抗体では3.5倍であった。このようにHoxD-13についてはEChIP-SEQを行い、モデル配列の濃縮を確認できる段階に到達した。HoxA-13については抗体量、クロマチン固定の至適条件検討が最終段階に到達した。
(2)Hox発現領域における標的遺伝子機能解析技術の開発
Hoxa-13:CreERT2-IRES venus SV40pAマウスを作成し、任意の発生段階で自脚特異的にCreを発現させて、コンディショナルノックアウトを行う系を構築し、またHoxa-13発現細胞の系譜追跡を行う。Hoxa-13遺伝子座にCreERT2-IRES venus SV40pA FRT pgkNeo FRTをノックインするための構築を作成し、ES細胞へのノックインとマウス化をCDBに依頼した。本構築のノックインES細胞についてネオマイシン選別に引き続くPCR選別により13クローンを得、次いでこれらについてサザン解析により正しくノックインが行われている6クローンを選別した。このうち3クローンをからキメラマウスを得、2系統については既にF1を得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)自脚軟骨増殖期におけるHox標的遺伝子の同定
H25年度中に、モデル標的遺伝子へのHoxタンパク質の結合が報告されているE11.0マウス胚肢芽を用いてパイロット的にChIP-SEQを行う予定でいた。しかし、クロマチンの固定条件と、免疫沈降の条件決定が予想外に難航してChIP-SEQがH25年度中には実施できなかった。担当者が手術を受けるため1ヶ月間緊急入院する事態になり、予定より進展が遅れたが、現在は完全に復帰してフルに研究に専念できている状態である。HoxD-13についてはほぼ条件検討が終了して、H26年4月にはMiSEQを用いたChIP-SEQを実施予定であり、HoxA-13の条件検討についても改善ポイントが絞り込まれているので、近日中にHoxD-13レベルの確実性が得られると考えられる。
(2)Hox発現領域における標的遺伝子機能解析技術の開発
Hoxa-13:CreERT2-IRES venus SV40pA FRT pgkNeo FRTキメラマウスは、当初計画ではH26年度に得ることになっていた。ノックイン構築の作成が順調に進み、ES細胞へのノックインやキメラマウス作成が極めて順調に進んだため、H26年度に予定していたノックインのF1個体がH25年度に得ることができた。Hoxa-13(-/-),Hoxd11～13(-/-)胚肢芽自脚領域でその発現の維持に支障が生じるJagged1をHox13の標的/下流遺伝子候補として着目し、Jag1 floxマウスを入手して繁殖を開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)自脚軟骨増殖期におけるHox標的遺伝子の同定
ChIP条件がほぼ決定できたHoxD-13については、MiSEQを用いたChIP-SEQによりモデル発生段階であるE11.0で既知の標的遺伝子の濃縮を確認する。HoxA-13についても近日中に条件決定が終了するので、同様にモデル系での実験を展開する。マウス13.5dpc胚より自脚領域を採取し、抗HoxA-13抗体及びHoxD-13抗体を用いたChIP-SEQ解析を実施する。ChIP-SEQ解析によって抗体による濃縮が確認された配列中で、特にシグナル因子遺伝子中もしくは近傍に存在する代表的な遺伝子について、ChIPによる濃縮をQ-PCRにより検討する。濃縮が再確認された配列と関連性の高いシグナル因子をHoxの標的遺伝子候補として、肢芽における発現様式を、野生型胚とHoxKO胚を用いて解析する。
(2)Hox発現領域における標的遺伝子機能解析技術の開発
まずHoxa-13:CreERT2-IRES venus SV40pA FRT pgkNeo FRT系統の染色体から、FLP発現マウスとの交配によりpgkNeoを除去して、今後の実験に使用できる状態にする。ついで自脚におけるCreやvenusの特異的な発現確認により使用できるマウス系統を特定し、ROSA26Rとの交配によりCreが機能することを確認する。自脚軟骨形成、成長過程でHoxa-13を発現する細胞の系譜をこの系で追跡する。自脚間充織で発現しHoxの下流に位置することが示されたJag1について、Jag1flox/flox,Hoxa-13:CreERT2-IRES venus,Cre-LacZ reporterマウスを交配により作成する。この遺伝子型の胎児を持つ妊娠マウスに、タモキシフェンを投与して任意の時間でJag1を自脚間充織で特異的に破壊し、その表現型を観察する。
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