2014 Fiscal Year Annual Research Report
PBAT法による高感度なエクソメチロームとエクソヒドロキシメチローム解析の実現
Publicly Offered Research
| Project Area | Personal genome-based initiatives toward understanding bran diseases |
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| Project/Area Number |
25129702
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
三浦 史仁 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50447348)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / ターゲット解析 / PBAT法 / バイサルファイトシークエンシング / 次世代シークエンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ターゲットメチロームシークエンシング（TMS）解析は、液相ハイブリダイゼーション（LH）法により特定のゲノム領域を濃縮し、得られたDNA断片をショットガンバイサルファイトシークエンシングに供してDNAメチル化状態を決定する手法である。この方法は、ゲノムサイズが比較的大きい生物において、配列決定のためのコストを抑制しながら高精度なメチロームデータを収集ことが可能であるが、これまでに報告されているTMSの鋳型調製法は大量の開始DNAが必要で実用性に欠けていた。そこで、本研究ではこれまで研究代表者らが開発してきたPost-bisulfite adaptor tagging（PBAT）法をTMSの鋳型調製に応用することで、TMSの高感度化を試みた。まず、標準的なPBAT法のプロトコールをLHにより回収されたDNAに適用したが、この系は再現性に乏しく改善の余地があった。そこで、PBAT法におけるランダムプライミング反応の高効率化と実験の再現性向上に取り組んだ。その結果、従来のPBAT法で用いていた3′末端に4塩基の完全縮重塩基が付加されたプライマーに比べて、数塩基のATのみの縮重塩基が追加されたプライマーを用いると、TMSの鋳型収量と実験の再現性が高まることが判明した。また、LHの条件検討を行い、ホルムアミド添加による十分な変性が実験の再現性向上に効果があることを見いだした。これらの検討結果を総合してSureSelect-PBAT法を確立し、論文をDNA Research紙に投稿した。さらには、アジレント社と協力しSureSelect-PBAT法のプロトコールの詳細をアプリケーションノートとしてまとめ公開した。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(3 results)
